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分離（isolation）、純化（purification）、繁殖（propagation）、保存（preservation）在柯霍氏法則：觀察病徵、由罹病組織分離病原、接種以及再次分離病原菌的步驟中，分離是將特定的病原微生物，以可行的方法使之與植物組織分離，但執行過程中並無法保證僅得目標微生物而無摻雜其他微生物，故應再進行純化（purification），如真菌常移植單一菌絲或單一孢子。分離或純化過程主要目標是獲得單純的微生物，所使用的方法或培養基通常未能獲得大量的微生物，故須再藉以適當養分的培養基給予適當的條件培養繁（propagation），得以獲得大量具有活力的微生物，以供接種、鑑定及研究其生物學特性。當所獲得的菌株暫時不用或無法同時掌控大量的菌株，則須尋求良好的保存方式，使之能長期保存，待有需要時可再移植獲得與保存前相同活力的菌株。（一）疑似病原之分離在地球上絶大多數物體表面會有多種的微生物存在，罹病之植物也不例外，故進行疑似病原之分離時，將罹病植物組織置放於分離培養基，若無適當的表面消毒，通常植體表面的微生物（通常與病害無關的腐生菌）會出現，干擾我們對疑似病原菌的判斷，故毒面消毒雖看來無關緊要，但操作不當常成為重要的實驗干擾因素。若罹病組織為細薄的組織，如幼根、細莖、薄葉等，常切小塊後經消毒水（如1%次氯酸鈉、0.1%昇汞水、等量95%酒精+5%次氯酸鈉…等）表面消毒後，經無菌水將消毒水漂洗掉再置於分離培養基，以去除雜菌而不損及組織內的病原菌為原則；較厚的組織如粗根、果實及微管束組織，用水洗淨並以消毒液擦拭表面後，撕開表皮，直接切取病組織(變色部位)進行分離。表面消毒的時間視所分離的菌種、組織之粗細厚薄而定。有時可以用添加多種藥劑或抗生素之選擇性培養基（selective medium）（附錄-C、D），使大部分的微生物無法生長，而某特定目標微生物得以長出。1. 組織分離法(Tissue plating method)(1) 病害標本以水洗淨瀝乾。(2) 以火燄滅菌之解剖刀切取病斑邊緣成2 -4m m之小塊(含部分健康組織及部分罹病組織約為2：1 ) 。(3) 置入盛有0.5-1%次氯酸鈉（sodium hypochlorite）消毒液之無菌培養皿，可區分為未經表面消毒、表面消毒30、60或120秒，再經無菌水漂洗 3 次，漂洗時間可為數十秒至數分鐘，視分離目標物及操作經驗而定。(4) 以火燄滅菌過的鑷子夾取一塊病組織，以滅菌的濾紙吸乾後，置入水瓊脂（附錄-A）平板中，每皿置4-5塊組織。(5)
靜置於桌面3 - 7天，觀察菌絲之生長情形。(6) 觀察過程中，以火燄滅菌的移植針，挑取不雜有細菌的菌落邊緣的菌絲塊，移入馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）平板或試管中培養。或細菌菌落以劃線法純化培養（見後述）。 實習準備材料（每組）：罹病植物、無菌培養皿2個、5%次氯酸鈉少量、無菌水適量、量筒大小各一、酒精燈、冷卻瓶、解剖刀、攝子、移植針、滅菌之吸水紙、WA8皿、PDA6管。2. 促進產孢法（induced sporulation）首先準備濕室（moist chamber）--無菌培養皿（塑膠袋或其他乾淨容器）內裝有潮濕（最好以無菌水濕潤）濾紙（或吸水紙），使容器內可保持高濕度。罹病植物組織置於濕室內1-3天，促進病原產孢。待病原菌產孢後，可直接以挑針挑起病原孢子培養。3. 寄主篩選法當罹病組織雜附有多種的微生物，並可能干擾疑似病原菌的分離，可經由適當的寄主組織篩選掉多餘的腐生菌，而使病原菌分離順利。如帶有疫病菌（Phytophthora spp.）之土壤或病組織，埋入茄子果實內部，經由上述濕室內培養1-3天待埋入物旁組織褐變，重複前述組織分離法，將茄子果實褐變組織內的疫病菌分離出來。4.
細菌的分離一般常用在細菌分離的方 法，是將植物罹病組織切開， 置於無菌水中，待細菌的菌流流出後，再利用劃線平板法（streaking platemethod），把細菌懸浮液劃在培養基平板上。 此外，也可利用稀釋平板法（dilution plate method），即可獲得單一菌落。。5. 病毒的分離是依序使用不同離心速率及條件，以達到從植物罹病組織分離病毒的目的。其中包括運用超高速離心（ultracentrifugation）、密度梯度離（density-gradient
centrifuge）等技術。病毒在經分離之後，便可進行接種，亦可利用電子顯微鏡觀察、進行血清學、核酸結構等研究。6. 線蟲的分離目前較常用的線蟲分離方法為改良式柏門氏漏斗分離法（modifiedBaermann
funnel method）、網篩法（sieving method）及離心懸浮法（centrifugal-flotation method）等。離心懸浮法特別適用在由田間土壤中分離根瘤線蟲的二齡幼蟲。改良式柏門氏漏斗分離法主要適用於由少量土壤樣本中分離出體型小且活動力強之線蟲，其方法是將土壤放在舖有兩張衛生紙的60孔目的網篩上， 在將網篩以45度角度緩慢置放於直徑7公分 的小漏斗中，以避免網篩底部產生氣泡。然後再漏斗下接一以夾子封口的橡皮管，其下再接一指形管。加蒸餾水至稍蓋滿供試土壤，靜置24小時後，即可收集下方指形管中的線蟲懸浮液。網篩法主要適用於由（二）病原微生物之純化觀念利用組織分離之執行過程中，應注意所分離之疑似病原有無摻雜其他微生物，若在此階段没有注意純化的步驟，有可能會誤導試驗結果，或待發覺得有異時，可能已經是數個月甚至數年以後了，故疑似病原菌純化的觀念應予以注意。以病毒為例，有時同一罹病株感染有2種或以上病毒，若分離病毒只是將這數種病毒顆粒自植物體內分離，並未將單一種病毒分開，若未進行純化，將嚴重影響後續的研究。真菌之純化培養常是移植單一菌絲或單一孢子，而細菌則常以單一菌落分離純化，病毒則以連續數次接種於白藜葉片造成單斑（locallesion），再取單斑分離培養，上述之微生物通常重複2-3次即可達到菌株純化的目的。（三）病原微生物之繁殖影響微生物培養的主要因子有：培養基、溫度、光線、酸鹼度及通氣性等。每種真菌（或卵菌Oomycetes）都可測試最適生長的培養基及其他培養環境條件，一般而言，PDA為最簡單廣泛使用的培養基（如附錄-B），而培養卵菌多使用蔬菜汁培養基（CV8 agar，如附錄-F），細菌多使用營養培養基（如附錄-E），但許多菌已有前人研究測試出某些適合的培養基、培養條件及處理方法，故分離純化出某些微生物後，應簡單鑑定後，去參考使用前人所推薦的方法。若要達到真菌大量產孢的目的，有時PDA並不適用，則需要較專門的培養基及處理方法，甚至同屬不同種的真菌所適用的培養基亦有所不同。如用PDA不適合用來培養尾子菌（ Cercospora spp. ）， Carrotleaf-decoction agar 被用來培養多種尾子菌，而 Peanut leaf-oatmeal agar被用來培養C.arachidicola。一種腐霉菌Pythium helicoids 並不會於CV 8a gar產生孢囊，須將之培養於CV8後，再切菌塊以無菌水漂洗再經低溫處理後，才易產生孢囊及釋放游走子。若要獲得大量的菌絲則亦可將真菌培養於液體培養基中，如PDB（potato dextrose broth）、CV8 broth均常被用於培養真菌產生大量菌絲，以供核酸或蛋白質萃取用。有些病原微生物無法於生物活體外繁殖，如白粉病菌、露菌、病毒、及一些不易培養之細菌、菌質體，此時應以活植株或部分植物器官、組織為培養基，如白粉病菌可以盆栽植物、切離葉或葉圓片來培養，但要注意後續試驗時不要摻雜了其他的微生物。培養及保存（Huang,
unpublished data）（四）病原微生物之保存當所獲得的菌株要長期保存時，最重要的目的是獲得與保存前相同活力的菌株。當欲保存的菌株並無確定有適當的保存方法時，則應選擇數種保存法，而保存前，應了解保存菌株之形態、培養性狀及致病力。下列為數種常用的長期保存方法。1. 定期移植（period transfer）：定期把尚有活力的菌移到新培養基上。輪流使用營養豐盛與低碳水化合物含量之培養基；使用菌絲生長最少但可大量產孢的培養基；宜用孢子少用菌絲；取用年輕菌絲尖端移植；培養溫度以4 -10℃可較維持久時間；絶對寄生菌以活植株或部分植物器官、組織來定期移植。培養時須注意通氣性、保存之溫溼度…等，並注意許多細菌及真菌適應腐生而失去病原性或產孢能力，亦可能變異。一般而言，定期移殖是耗費時間及勞力，但若找不到好方法也只能如此。2. 礦物油（mineral oil）：先讓微生物於試管中固態培養基上旺盛生長，再將礦物油倒入管內覆蓋於其上。使用比重0.86~0.89醫藥級礦物油，連續2次高壓滅菌後，在170℃下乾燥1~2小時。冷卻後把無菌礦物油加到培養之病原菌已生長至相當程度的培養基斜面中，約1公分高，保存在冰箱或室溫中。注意事項：油層太深會造成氧氣擴散不良；更新培養時，第一次移植因為有油的關係，會長得較慢；斜面的頂部未蓋到礦物油，培養基會乾涸；因為在油下仍繼續生長，形態、生理及產孢均有可能發生變化；產生酸或能液化培養基及對油敏感的病原菌不適合以此法保存。。3. 乾燥（dry）：一些病原微生物可於乾燥的寄主組織或培養基生存，尤其是較低溫的環境下，可維持活力達數年之久。把菌培養在培養基中。待菌落長滿後，取出培養基，放在兩層無菌吸水紙之間，置於裝有氯化鈣的乾燥箱中，0~ 20℃乾燥。乾燥後，放入密閉容器內，保存在低溼度的冰箱或室溫中。4. 保存於無菌水（storage in water）：非常簡單及實用，但非適用於所有菌，卵菌及細菌怕乾，故頗為合適。將數塊菌絲塊或細菌菌泥置7-20於盛有無菌水之螺帽玻璃試管內，並予以密封避免水蒸發致乾。要使用時，將菌絲塊取出培養，或將水中細菌劃線於NB上繁殖。5. 保存於矽膠粒（storage
in silica gel）：當無法使用低壓乾燥或液態氮保存時，可使用矽膠保存。可通過6 -20 m esh網篩大小之矽膠粒經180℃90min滅菌後，盛於可密閉之小瓶內，以10%脫脂牛奶做成欲保存之真菌孢子濃縮懸浮液，或10%脫脂牛奶與甘油1:1做作log phase之細菌菌體濃縮懸浮液，將孢子（菌體）濃縮懸浮液及盛有矽膠粒之小瓶於冰浴內預冷，將懸浮液加入盛有矽膠粒之小瓶內，約0.5-0.75%水分（約0.5ml/ 4g ），並搖動小瓶使矽膠粒與懸浮液混合均勻，再冰浴30min，於室溫2-7天後，取少量測試保存之菌有無活力，確定有活力後再密封，於4℃ 或-20℃ 保存。6. 保存於土壤（storage in soil）：含水量20%的土壤，放在螺旋蓋的瓶子或試管中，連續三天各高壓消毒一次後，加入一毫升濃孢子懸浮液，混和均勻，在蓋子鬆蓋的狀況下，室溫下乾燥一週，然後旋緊蓋子，放在冰箱中保存。更新時，取用少量土灑在適當的培養基上即可。或土壤瓊脂（soil agar）：取適量的蒸餾水，加入10%過篩烘乾後的壤土及0.8~1%的瓊脂，裝在螺旋蓋試管中，間歇消毒三次，每次消毒後將砂管混合均勻，待冷卻後把要保存的病原菌移入砂管，於室溫下保存。7. 冷凍（freezing）：大部分病原微生物於冰點以下會死亡，但有些置入冰點以下的環境中，數日後再回溫而仍存活，表示可利用冷凍來長期保存。其中最好將病菌置入懸浮介質（suspension substrates）中，再保存於冰凍箱(freezer)中冰凍。通常一種或兩種懸浮介質可通用於大部分微生物，但有些則需要特別者。適於一病原之懸浮介質不一定適用另一病原，即使是同一病原的不同生理小種亦是如此。8. 保存於液態氮（preservation in
liquid nitrogen）：液態氮溫度-196℃ 幾乎生物代謝停止，將微生物置於安瓿瓶內密封存於液態氮為ATCC（ American Type Culture Collection ）
及CMI （ CommonwealthMycological
Institute）標準保存方法，因不易變異及不影響形態及病7-21原性。若以氣態空間保存則可用抗凍的聚丙烯塑膠小瓶，若以液態空間則需玻璃安瓿瓶。安瓿瓶內須添加抗凍劑（cryoprotectivesolution，如10-30%甘油），而直接將裝有抗凍劑與微生物的安瓿瓶丟入液態氮桶內，常會對微生物造成傷害，故序列降溫機可避免冰點期造成的冰晶破壞細胞9. 低壓及真空乾燥（lyophilization and vacuum drying）：冷凍乾燥或真空乾燥法為最常用之方法，幾乎所有細菌、酵母菌及大多數真菌以此法保存之效果良好，其原理是藉由高真空乾燥法，降低孢子水分含量至2~3%，將病原菌保存在無氧及水氣的狀態下。須具備有低壓乾燥設備，步驟大約為：(1)孢子（細菌菌體）懸浮液預凍；(2) 冷凍真空乾燥；(3)室溫真空乾燥；(4)真空封瓶（sealing
of the ampules invacuo）。

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接種、分離純化和培養技術    一、接種
將微生物接到適於它生長繁殖的人工培養基上或活的生物體內的過程叫做接種。 １、接種工具和方法 在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環、接種針。由於接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養基表面要將菌液均勻塗布時，需要用到塗布棒。常用的接種方法有以下幾種：
１）劃線接種 這是最常用的接種方法。即在固體培養基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。
２）三點接種 在研究黴菌形態時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落後，來觀察、研究它們的形態。除三點外，也有一點或多點進行接種的。
３）穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常採用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養基一般是半固體培養基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺，如某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。
４）澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養皿中，然後再倒入冷卻至45°C 左右的固體培養基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到稀釋的目的。待平板凝固之後，置合適溫度下培養，就可長出單個的微生物菌落。
５）塗布接種 與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然後再將菌液倒入平板上面，迅速用塗布棒在表面作來回左右的塗布，讓菌液均勻分佈，就可長出單個的微生物的菌落。
６）液體接種 從固體培養基中將菌洗下，倒入液體培養基中，或者從液體培養物中，用移液管將菌液接至液體培養基中，或從液體培養物中將菌液移至固體培養基中，都可稱為液體接種。
７）注射接種 該法是用注射的方法將待接的微生物轉接至活的生物體內，如人或其他動物中，常見的疫苗預防接種，就是用注射接種，接入人體，來預防某些疾病。 ８）活體接種
活體接種是專門用於培養病毒或其他病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種於活的生物體內才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料餵養。
２、無菌操作 培養基經高壓滅菌後，用經過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）於培養基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。
實驗臺面不論是什麼材料，一律要求光滑、水準。光滑是便於用消毒劑擦洗；水準是倒瓊脂培養基時利於培養皿內平板的厚度保持一致。在實驗臺上方，空氣流動應緩慢，雜菌應儘量減少，其周圍雜菌也應越少越好。為此，必須清掃室內，關閉實驗室的門窗，並用消毒劑進行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數量。
空氣中的雜菌在氣流小的情況下，隨著灰塵落下，所以接種時，打開培養皿的時間應儘量短。用於接種的器具必須經幹熱或火焰等滅菌。接種環的火焰滅菌方法：通常接種環在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉動一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養基，待接種環冷卻到室溫後，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養基上。（圖３－４）然後，將接種環從柄部至環端逐漸通過火焰滅菌，復原。不要直接燒環，以免殘留在接種環上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培養皿的蓋打開一小部分進行接種。在向培養皿內倒培養基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應傾斜一下在火焰上通過。
二、分離純化 含有一種以上的微生物培養物稱為混和培養物（Mixed
culture）。如果在一個菌落中所有細胞均來自於一個親代細胞，那麼這個菌落稱為純培養（Pure
culture）。在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱為分離純化，方法有許多種。 １、傾注平板法 首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營養瓊脂培養基充分混合，然後把這混合液傾注到無菌的培養皿中，待凝固之後，把這平板倒置在恒箱中培養。單一細胞經過多次增殖後形成一個菌落，取單個菌落製成懸液，重複上述步驟數次，便可得到純培養物。２、塗布平板法
首先把微生物懸液通過適當的稀釋，取一定量的稀釋液放在無菌的已經凝固的營養瓊脂平板上，然後用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地塗布在培養基表面上，經恒溫培養便可以得到單個菌落。
３、平板劃線法 最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環取培養物少許在平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。當接種環在培養基表面上往後移動時，接種環上的菌液逐漸稀釋，最後在所劃的線上分散著單個細胞，經培養，每一個細胞長成一個菌落。
４、富集培養法 富集培養法的方法和原理非常簡單。我們可以創造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。所創造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養基和培養條件下，經過多次重複移種，最後富集的菌株很容易在固體培養基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。通過多次重複移種便可以得到純的寄生菌。５、厭氧法
在實驗室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養基的試管作為培養容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數分鐘，以便逐出培養基中的溶解氧。然後快速冷卻，並進行接種。接種後，加入無菌的石蠟於培養基表面，使培養基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種後，利用N2或CO2取代培養基中的氣體，然後在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種於培養基上，然後再把培養皿放在完全密封的厭氧培養裝置中。
三、培養 微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。微生物的種類不同，培養的方式和條件也不盡相同。１、影響微生物生長的因素
微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多因素的影響。影響微生物生長的因素很多，簡要介紹如下。1) 營養物濃度
細菌的生長率與營養物的濃度有關:μ=μmax*C/(K+C) 營養物濃度與生長率的關係曲線是典型的雙曲線。 K值是細菌生長的很基本的特性常數。它的數值很小，表明細菌所需要的營養濃度非常之低，所以在自然界中，它們到處生長。然而營養太低時，細菌生長就會遇到困難，甚至還會死亡。這是因為除了生長需要能量以外，細菌還需要能量來維持它的生存。這種能量稱為維持能。另一方面，隨著營養物濃度的增加，生長率愈接近最大值。
２）溫度 在一定的溫度範圍內，每種微生物都有自已的生長溫度三基點：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點內，微生物都能生長，但生長速率不一樣。微生物只有處於最適生長溫度時，生長速度才最快，代時最短。超過最低生長溫度，微生物不會生長，溫度太低，甚至會死亡。超過最高生長溫度，微生物也要停止生長，溫度過高。也會死亡。一般情況下，每種微生物的生長溫度三基點是恒定的。但也常受其他環境條件的影響而發生變化。
根據微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個類型： a.嗜冷微生物：其是適生長溫度多數在-10℃ －20℃ 之間 b.中溫微生物：其最適生長溫度一般在20℃ －45℃ 之間 c.嗜熱微生物：生長溫度在45℃ 以上。 ３）水分 水分是微生物進行生長的必要條件。芽孢、孢子萌發，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長發育的水分活性範圍內，均具有狹小的適當的水分活性區域。４）氧氣
按照微生物對氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個類型。 a.需氧微生物 這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大於大氣中氧氣濃度的條件下生長。絕大多數微生物都屬於這個類型。 b.兼性需氧微生物 這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下，都能生長，只不過所進行的代謝途徑不同罷了。在無氧氣存在的條件下，它進行發酵作用，例如酵母菌的無氧乙醇發酵。 c.微量需氧微生物 這類菌是需要氧氣的，但只在0.2大氣壓下生長最好。這可能是由一它們含有在強氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。 d.耐氧微生物 這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會被氧氣所殺死。 c.厭氧微生物 這類微生物在生長過程中，不需要分子氧。分子氧存在對它們生長產生毒害，不是被抑制就是被殺死。 ２、培養方法 1）根據培養時是否需要氧氣，可分為好氧培養和厭氧培養兩大類。 好氧培養：也稱“好氣培養”。就是說這種微生物在培養時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養多數是通過搖床振盪，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。
厭氧培養：也稱“厭氣培養”。這類微生物在培養時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養過程中，最重要的一點就是要除去培養基中的氧氣。一般可採用下列幾種方法： a.降低培養基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養基中，便可達到目的。有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養基中，也可適合厭氧菌的生長。 b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養吸收氧氣；用植物組織如發芽的種子吸收氧氣；用產生氫氣與氧化合的方法除氧。 c.隔絕阻氧：深層液體培養；用石蠟油封存；半固體穿刺培養。 d.替代驅氧
用二氧氣碳驅代氧氣；用氮氣驅代氧氣；用真空驅代氧氣；用氫氣驅代氧氣；用混和氣體驅代氧氣。 ２）根據培養基的物理狀態，可分為固體培養和液體培養兩大類。固質培養：是將菌種接至疏鬆而富有營養的固體培養基中，在合適的條件下進行微生物培養的方法。
液體培養：在實驗中，通過液體培養可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。
博碩士研究論文:
1.中草藥對肝炎之研究探討...實踐大學食品營養所93碩士論文　
2.固態發酵樟芝對小鼠免疫調節及抗腫瘤...南台科技大學生技所93碩士論文
3.樟芝酒製備及功能性評估...南台科技大學生技所93碩士論文
4.利用動物細胞監測發酵培養的樟芝之生物活性...清華大學生物資訊與結構生物所93碩士論文　
5.牛樟芝菌絲體對腫瘤細胞的影響...南台科技大學生技所92碩士論文
6.中草藥發酵產物對抑制腫瘤細胞之功能性評估...南台科技大學生技所92碩士論文
7.利用蛋白質體探討樟芝萃取物處理在人類肺癌細胞株(A549)...南台科技大學生技所92碩士論文
8.不同發酵碳源之牛樟芝菌絲體發酵過濾液對人類肝癌細胞株之影響...台灣大學食科所92碩士論文
9.不同培養時間生產之樟芝發酵液對癌細胞生長之影響...台灣大學食科所92碩士論文
10.樟芝抗腫瘤活性之研究...成功大學藥理所92碩士論文　
11.高產率牛樟芝菌絲體及產物產程的開發...長庚大學生化與生醫工程研究所92碩士論文　
12.樟芝發酵液之抗發炎及其誘導癌細胞凋亡機制之探討...中國醫藥大學營養研究所92碩士論文　
13.牛樟芝不同極性區分保肝機能性之研究...中山醫學大學營養研究所92碩士論文　
14.不同培養方式對樟芝多醣及乙醇抽出物生產之研究...大葉大學生物產業92碩士論文
15.牛樟芝(Antrodia camphorata)液體培養及其成分分析...屏東科技大學熱帶農業所92碩士論文
16,高通量篩選出牛樟芝菌絲體抗肝癌先導藥物化合物...中正大學化學所92碩士論文
17.樟芝深層醱酵液之成分分析...實踐大學食品營養所92碩士論文　
18.針葉樹對樟芝菌絲體生長促進因子及樟芝菌絲體成分研究...台北醫學大學生藥所91碩士論文
19.樟芝深層培養液抗氧化及抗腫瘤特性之研究...中興大學食品科學研究所91博士論文
20.樟芝活性多醣體之生物活性及免疫調節抑制腫瘤之研究...台灣大學生化所91博士論文
21.樟芝中免疫調節蛋白的純化與其生理活性之探討...台灣大學園藝所91碩士論文

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生物反應器動植物細胞罐提供從實驗室2.5L罐到大規模生產35KL罐的一系列設備，並可根據用戶需要提供特殊要求的生物反應器公司曾經為某美國製藥企業提供35KL的紅豆衫細胞生產線，生產線通過美國FDA認證，為目前唯一通過FDA認證的生產紫杉醇的細胞生產線。


結果與討論一、不同細胞系的生長速率與紫杉醇含量比較將五個不同來源的細胞系(A-E)，以100 g·FW/L細胞接種密度培養於含NAA或2,4-D的培養基，所選用的植物生長素與濃度，是依據先前癒合組織生長結果最好的培養基修正而來(Chang et al. 1996)。培養21 d後測量細胞鮮重，發現細胞系間生長速率呈現明顯差異(Fig. 2)。以細胞系A與B生長率最好，鮮重可增加4.5~4.8倍，細胞系E生長最差，最高只增加1.3倍。對生長最佳的3個細胞系而言，培養基以含有5 mg/L 2,4-D時生長最好。觀察培養液，發現細胞系A培養液呈透明，細胞為白色，顯微鏡下為單一細胞；其他細胞系的培養液與細胞都呈淡棕色，除了細胞系B的細胞會長大成為瘤狀的顆粒狀以外，其他3個細胞系之大部分細胞呈單細胞狀，偶有一些由25個細胞以下聚集的
分析taxane在細胞與培養基的分佈情形，發現4個可生產taxane的細胞系(細胞系B-E)，其80%以上的DB與BC會釋於培養基中，而紫杉醇則相反，80%以上的紫杉醇都保存在細胞中。DB與BC兩種taxane在不同紅豆杉樹種之細胞培養的結果都蠻一致的，即絕大部分都會釋出細胞而存在於培養基中；而紫杉醇則依細胞系而異，如T.
baccata (Hirasuna et al. 1996)、與T.
canadensis有90%以上的紫杉醇會釋出於培養基中(Ketchum
et al. 1999)，T. cuspidata的細胞培養則不同研究有些差異，分別報告紫杉醇有66% (Fett-Neto
et al. 1994)或90%以上(Ketchum
et al. 1999)會釋出於培養基，T. chinensis細胞培養，只有10-25%的紫杉醇會釋出於培養基(Wang
et al. 1997, 2001)，而T. x media細胞的紫杉醇只有很少量或完全不會釋出於培養基，而是保存在細胞中(Wickremesinhe
and Arteca 1994)。
比較細胞生長與紫杉醇生產發現，細胞系A生長最好，細胞培養也完全沒有褐化問題，但卻沒有任何紫杉烷類物生產。細胞系C與E的生長差且紫杉醇含量亦低。細胞系B的生長佳且taxane產量也高，細胞培養會形成大小不一的瘤狀細胞團，最大的直徑可達3 -4 mm
(Fig. 4)。瘤狀細胞團在其他的紅豆杉細胞也有報導，一般認為以瘤狀細胞團來生產紫杉醇可能比完全未分化的細胞穩定(Ellis et al. 1996)。而細胞系D的生長雖不是最快，但taxane與DB，BC含量均為五個細胞系中最高，可做為最佳用以生產紫杉醇的細胞系。因此，細胞系B與D兩個細胞系值得進一步培養並監測其長期培養紫杉醇生產的穩定性。二、細胞培養接種起始密度對生長的影響台灣紅豆杉細胞系D以不同細胞起始密度培養於WN培養基，以具側管之三角瓶培養並測量其沈降體積比(Fig.
1)及細胞之鮮乾重作為生長速率之指標。不論以體積、鮮重或乾重為指標，細胞的生長都以起始密度為100 g·FW/L
(=1/10 (w/v))最佳(Figs. 5, 6)，培養24 d後，細胞之生長量可增加3-3.5倍，此時細胞體積可達總培養體積的48.3%。起始密度50 -75 g /L之培養組的細胞生長量可增加2-2.6倍。在更高或更低之起始密度的試驗組，細胞生長較差，尤其是在低細胞密度者，細胞生長受阻，培養24天生長量只增加0.3-0.8倍。此結果與T. media的細胞培養試驗近似，其細胞生長以接種密度為80 -110 g ·FW/L最佳，密度若低於50 g·FW/L則生長嚴重受阻(Wickremesinhe and
Arteca 1994)。在T. chinensis的細胞接種試驗也有相似的結果，當細胞以18 -75 g ·FW/L之起始密度培養，發現在密度為75 g·FW/L時，細胞生長最佳(Wang et al. 1997)。至於細胞密度過高導致生長變差，推測可能原因，是細胞數量過多導致養份不足以充分供應細胞所需所致。
細胞培養之細胞量加倍時間(doubling time)，一般以體積、鮮重或乾重來表示，為了不干擾細胞生長，我們以體積來計算(Fig. 5)。在本試驗所採用之接種密度條件下，生長曲線並無明顯之潛蟄期(latent phase)，細胞加倍時間受細胞培養之起始密度影響，起始密度介於50 -100 g ·FW/L時，細胞的生長最快，細胞加倍時間約發生於培養的第6
d (Fig. 5)。其次為密度150 g·FW/L之培養，細胞量加倍需時9 d，而密度為25 g·FW/L與200 g·FW/L之細胞培養，到試驗結束的第24 d，細胞量仍未加倍。有關紅豆杉細胞培養，雖然所用以計算細胞加倍時間的方法並不同，但除了少數在6 d以下外，大都在發生在14-20 d之間(Wickremesinhe and Arteca 1994, Fetto-Neto et al. 1995,
Jaziri et al. 1996, Phisalaphong and Linden
1999)。因此，台灣紅豆杉細胞系D的生長速率並不亞於其他種類的紅豆杉細胞。以顯微鏡觀察，細胞系D培養液內有許多8-25個細胞組合在一起的團聚細胞，但大部分為單一細胞。培養液的顏色在起始密度低於100 g·FW/L時多為淡棕色，若密度超過100 g·FW/L，則培養液的顏色變深，尤其是200 g·FW/L的培養液多呈黃褐色至深褐色(Fig. 7)。三、不同新舊培養液比例對繼代培養細胞生長之影響將細胞系D以50 -150 g ·FW/L之接種密度配合不同比例之新、舊培養基，培養21
d，發現
細胞密度、舊培養液(細胞加舊培養基)與新培養基比例會影響細胞生長與培養液顏色(Table 1)。新培養基過多會導致培養液與細胞變紅色且細胞生長受阻，尤其在完全不添加舊培養基的狀況下最為嚴重，而此現象與細胞密度無關。一般而言，細胞密度低(50 -100 g ·FW/L)時，舊與新培養液之比例在3:7-5:5，細胞生長最佳且培養液也不會有變紅或轉褐的現象產生。提高細胞密度( 150 g ·FW/L)時，所需的新培養液較多，細胞生長最佳的舊與新培養液比例為3:7~4:6，且當舊與新培養液比例為4:6~5:5時，培養液就會有褐化現象產生，可能因為細胞密度高，需要較多的新鮮培養基。紅豆杉屬植物組織與細胞培養的褐化問題一直無法完全解決，在細胞培養常觀察到的培養基或細胞變紅或變褐的現象即為細胞褐化所產生，一般認為可能為酚類化合物氧化所產生，此現象會導致細胞死亡(Fett-Neto
et al. 1994, Wickremesinhe and Areca, 1994, Wang et al. 2001)。Wickremesinhe和Arteca
(1994)發現在培養基中添加1% PVP10並不會減輕紅色分泌物的產生，但會使細胞活著且繼續生長。在我們的試驗中發現，控制繼代培養時細胞的密度與新舊培養基比例，可以避免細胞培養產生褐化現象，而使細胞快速生長。
四、細胞連續培養方法之建立細胞系D以1
L三角瓶進行不同接種密度之連續培養，在培養期間的第15，30與45
d，更換培養基；於前兩次分別以150 mL新培養基更換等量之舊培養基，而第三只更換100 mL舊培養基，培養60
d後測量細胞生產量，結果顯示在此系統下培養的細胞可一直生長(Fig. 8)。在細胞起始密度為50 -75 g ·FW/L之培養組，最後的細胞體積可達總培養體積的61-63%，且培養液的顏色都可維持在淡棕色。以細胞體積增加比例而言，細胞起始密度為25 g·FW/L鮮重的培養，雖然培養初期，由於細胞數少，所以第一次繼代培養前，細胞只增加了41%，但第二次繼代培養後，細胞即快速生長，培養60
d後，細胞體積可由原來的3.15%增加為39.3%，共增加了11.5倍為最多，且由於此時之細胞體積只有總體積的39%，所以推測若繼續培養仍有生長空間。起始密度為50 g·FW/L之實驗組，培養60天後之細胞可增加10.7倍；增殖比最差的是細胞接種密度為75 g·FW/L的培養組，細胞體積只增加了7.62倍。與前述定積培養結果相比較，發現定積培養時，接種密度為培養的限制因子，低細胞接種密度下培養24
d，細胞生長少，而以連續培養方式卻以低接種密度之細胞生長量增加的倍率最高，似乎相矛盾。事實上連續培養在培養的前30
d細胞生長量也是很低，但由於每15 d更換添加新培養基，所以細胞生長雖緩慢仍較定積培養為佳，到培養30
d後，細胞密度已約達75
g·FW/L左右，加上新鮮培養基的刺激，細胞即開始呈現快速生長。
一般細胞培養都是採用定積培養(batch
culture)，即細胞培養於固定容積的培養基中，細胞分裂及生長而增加生物量，直到培養環境(營養或氧氣等)成為限制因子。而連續性培養，則是在細胞培養過程中加入新鮮培養基，並平衡收集舊培養基(Street
1979)。定積培養時，約每10-14 d左右進行一次繼代培養以維持細胞生長活力，繼代培養時將原來的母瓶分成2-5瓶，再加入新鮮培養基，進行新的培養(Ketchum
and Gibson 1996, Mirjalili and Linden 1996)。以此方式培養細胞，需要很多的震盪器，且幾次繼代下來，每一瓶的細胞差異變大，基於最後細胞培養將放大以生物反應器來培養，屆時需要數瓶三角瓶的細胞一起加入生物反應器，為減少細胞變異，且降低培養空間，同時生物反應器培養細胞一般亦是以連續培養方式進行，因此我們發展以1 L三角瓶的連續培養台灣紅豆杉細胞方法，結果也確實顯示，在此系統下培養了2個月的細胞均可維持良好的生長狀態。結論利用紅豆杉細胞培養方法生產紫杉醇，其成功的主要關鍵，一般認為首在細胞篩選，最好的細胞系應具備生長快速且紫杉醇含量高的特性(Zhong 1995, Hirasuna et al. 1996, Ketchum et al. 1996)。另外，Hirasuna et al.
(1996)認為紫杉醇的合成過程對環境的變化很敏感，產量會受培養條件之輕微改變的影響，所以培養時的各種條件因子，如細胞之起始密度、培養基組成、繼代時間和溫度等都必須嚴格控制。此外，生長素對長期之細胞培養來生產二次代謝物的穩定性影響(Ketchum and Gibson 1996)也是重要關鍵之一，唯有有效掌控這些基本細胞之培養條件，再加上後續的紫杉醇誘導與生物
反應器放大試驗，才能成功的利用細胞培養生產紫杉醇(Zhong
1995)。在本試驗中，我們建立台灣紅豆杉細胞培養方法，包括最佳的細胞接種密度、培養基組成、繼代培養與連續培養方法，對紅豆杉細胞培養常會產生的紅色或褐色分泌物(褐化)問題，提出解決辦法，也發現不同細胞系間的taxane含量存在很大的差異，目前選出細胞增生率與taxane生產都很高的細胞系B與D。未來將繼續培養與篩選具更高生產taxane能力的細胞系，並進行紫杉醇增產試驗與生物反應器放大之培養試驗，以期利用台灣紅豆杉細胞培養方式達到商業化生產紫杉醇的目的。
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順鉑（Cisplatin，CDDP）是一種含鉑的抗癌藥物，即順式-二氯二氨合鉑(II)，棕黃色粉末，屬於細胞周期非特異性藥物，對肉瘤、惡性上皮腫瘤、淋巴瘤及生殖細胞腫瘤都有治療功效。它是一大類鉑類藥物中最早被合成的一個，結構最簡單且作用機理明確，它的發現又導致了其他抗癌藥物的研製，包括卡鉑、奧沙利鉑、奈達鉑及賽特鉑等。
­張淑華等―台灣紅豆杉之細胞培養  經調查發現，除了太平洋紫杉，紫杉醇也存在其他紫杉屬植物的各部分組織中，其含量因不同樹種、單株、組織，甚至栽植環境而異，最高含量約為乾重的0.01-0.045% (Jaziri et al. 1996, Ho et al. 1997)。目前紫杉醇之主要來源為紫杉屬植物的樹皮與枝葉萃取物，由於受限於含量低，加上紫杉屬植物生長緩慢，因而無法大量生產提供製藥需求(Cragg et al. 1993)。紫杉醇的全合成方法雖已完成，但由於步驟多，且收率低，而無法達到商業化生產之目的(Nicolaou et al. 1994)；利用組織培養生產紫杉醇被認為是一種深具潛力的方法，最近相關研究報告很多。除了基本細胞培養方法的建立(Fett-Neto et al. 1994, Wickremesinhe and
Arteca 1994, Ketchum and Gibson 1996)以外，也有許多研究探討改變培養基組成或培養方法以提高紫杉醇或紫杉烷類化物的產量；目前較有效的方法有：以不同種類糖的組合來取代一般培養用的蔗糖培養細胞或在培養過程中添加糖類(Hirasuna et al. 1996, Ketchum and Gibson
1996)或methyl jasmonate (Ketchum et al. 1999,
Yukimune et al. 2000)，改變氣體組成並以methyl jasmonate誘導(Mirjalili and Linden 1996, Phisalaphong and Linden
1999)，或提高培養溫度(Choi et al. 2000)等，都可以增加紫杉醇產量。雖然有關紅豆杉的細胞培養研究報告相當多，但針對台灣紅豆杉細胞培養的研究不多，Ma等(2002)發現紫杉醇含量在細胞自然死亡(apoptotic cell death)時可達最高( 14.2 m g/L)；Yuan等(2001)在培養基中添加吸附劑與前驅物可使紫杉醇由3.4 mg/L增加5倍達16.7 mg/L。本試驗研究目的在建立台灣紅豆杉細胞培養方法，並比較不同來源細胞生長與紫杉醇含量差異，以提供作為進一步紫杉醇誘導試驗之依據材料與方法一材料實驗材料有台灣紅豆杉的胚體、胚培養苗及成熟樹葉片。胚來自層積保存於4℃的種子，胚培養苗的培育方法請參考我們先前發表之報告(Chang and Yang 1996)，成熟樹葉片則採集自中橫的台灣紅豆杉天然母樹。
二、癒合組織誘  以胚、6個月大無菌胚培養苗之葉片、及成熟樹葉片誘導癒合組織。無菌苗葉片不需消毒，種子與成熟樹幼嫩葉片，則經酒精與次氯酸鈉消毒，並以無菌水清洗後，切開種皮與胚乳取出完整胚，葉片則切成約0.5×0.5 cm2大小，培養於WPM基本培養基(Lloyd
and McCown 1981)內含30 g/L蔗糖，2 mg/L NAA (naphthaleneacetic acid)或5 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)，0.8
g/L PVP (polyvinylpyrrolidone 40000)，0.1
g/L casein hydrolysate (CH)，100 mL/L coconut milk (CM)等誘導癒合組織，詳細培養方法可參考我們已發表之報告(Chang et al. 1996)。癒合組織培養於溫度為25±2℃之黑暗培養室，每4-5週定期繼代培養一次.三、細胞培養選已培養2年之5種不同來源的癒合組織(細胞系A-E)進行細胞培養試驗。細胞系A與B誘導自胚，細胞系A生長佳，細胞顏色白且結構鬆軟；細胞系B生長速率中等，為黃棕色之瘤狀組織(nodule)；細胞系C與D分別來自成熟樹葉片與莖段，細胞系E源自試管苗葉片，三個細胞系約為生長中等，顏色介於黃到棕色，細胞鬆軟偶有瘤狀組織。分別秤取鮮重5 g之癒合組織培養於含60 mL培養基的250 mL三角瓶中，培養基為WPM基本培養基添加30 g/L蔗糖，0.1 g/L CH，100 mg/L CM(簡稱W培養基)，與2 mg/L NAA(W培養基＋2 mg/L NAA，簡稱WN培養基)，每兩週繼代培養一次。繼代培養方法為取出1/2 (30 mL)不含細胞之培養液後加入等量新鮮WN培養基，培養一個半月後進行細胞生長試驗。(一)不同生長激素對台灣紅豆杉細胞生長的影響以1個半月大之台灣紅豆杉A-E共5個細胞系進行試驗，培養基為W培養基添加2、5 mg/L
NAA或5 mg/L 2,4-D。細胞起始密度為100 g·FW/L (FW=fresh
weight)，新舊培養液比例為1:2.5。方法為將A-E細胞之培養液以(Miracloth Calbiochem, La Jolla, CA)過濾，分開細胞與培養基(此培養基稱之為舊培養基)。分別秤取2 g鮮重(FW)的細胞，置於50 mL三角瓶，加入舊培養基至體積為6 mL，再加入15 mL新鮮配好培養基，培養液總體積為21 mL。培養21 d後，將培養液過濾後秤量細胞總鮮重。(二)不同細胞系之紫杉烷類(taxane)含量的測定將A-E五個細胞系以細胞密度為100 g·FW/L，培養基為WN，新舊培養液比例為1:2.5，總體積為21
mL，以50 mL三角瓶培養，細胞秤取與培養基定量方法同上(一)所述。培養21 d後，將培養液過濾，收集細胞與培養基，分開萃取並測量taxanes含量。細胞先以液態氮冷凍後，置於冷凍乾燥機去除水分，以10 mL甲醇(methanol)在超音波震盪器中萃取30 min，置入離心機以1000 xg離心5 min後收集上清液，沈澱物再以methanol萃取1次，將2次萃取液合併備用。培養基以二氯甲烷分液萃取，有機萃取液以旋轉型蒸發器(rotary evaporator, Eyela)減壓濃縮乾燥，再以1.5 mL甲醇溶解，用0.2 μm濾膜(AcrodiscR Lc 13 PVDF)過濾後，取10 μL溶液以高效能液相層析儀(HPLC, Series 200L c
pump, Perkin-Elmer Co.)，經光電二極體偵測器 ( 235c Diode
Array Detector, Perkin-Elmer Co.)分析。所使用的管柱為Lichrospher RP-18 (250×4 mm, particle size: 5 μm, endcapped, Merck Co.)，移動相(mobile phase)之沖提溶液組成為methanol：acetonitrile：H₂O = 20:38:42，流速為1 mL/min，偵測波長為230 nm (Ho et al. 1997)。紫杉醇(簡稱TX)、10-去乙醯巴卡亭III (10-deacetyl baccatin III，簡稱DB)，與巴卡亭III (baccatin III, 簡稱BC)等三種紫杉烷標準品購自Sigma Company。(三)細胞接種之起始密度對台灣紅豆杉細胞生長的影響一個半月大之台灣紅豆杉細胞系D培養液以Miracloth過濾，分別秤25, 50, 100, 150, 200 g鮮重細胞，置於1 L培養基中進行試驗，其中細胞密度為25 -100 g ·FW/L的試驗，將秤好之細胞放入量筒，加入舊培養基至體積為18 mL，再加入新鮮配好之WN培養基45 mL，使總培養體積為63 mL，新舊培養液比例為1:2.5；細胞密度為150與200 g·FW/L之試驗，由於細胞較多，因此將細胞加舊培養基體積增加為24.8
mL，新鮮WN培養基減為37.2 mL，兩者比例為1:1.5，總體積也定量為63 mL。將定量好之培養液倒入具有15 mL側支量管的250 mL三角瓶，進行細胞接種密度試驗。每3 d測量一次體積，測量時，旋轉三角瓶使細胞均勻懸浮後，小心將15
46 張淑華等―台灣紅豆杉之細胞培養  (四)繼代培養新舊培養液比例對台灣紅豆杉細胞生長之影響以細胞系D作為試驗材料，細胞起始接種密度為50 -150 g ·FW/L，細胞秤取後加入不等比例之舊培養基及新鮮WN培養基組合成總體積為20 mL培養液，培養於50 mL三角瓶，方法同上(一)所述，培養21 d後記錄細胞體積並觀察培養液顏色。(五)細胞連續培養(continuous culture)方法之建立以細胞系D為材料，細胞接種起始密度為25、50或75 g·FW/L，分別秤取所需細胞後加入舊培養液至90 mL，再加入210 mL新鮮的WN培養基使總培養液體積為300 mL，倒入1-L三角瓶中培養，共培養60 d。在培養的第15, 30與45 d取出三角瓶，將三角瓶傾斜50o角靜置25 min後，細胞團會因重力沈澱在下方，小心吸出上面不含細胞的舊培養基，在第15和30 d時吸出150 mL，在第45
d時因細胞體積增加，只取出100 mL舊培養基，取出培養基後，立刻加回等體積之新鮮WN培養基，再將三角瓶放回震盪器中培養；培養期間每3 d取出5
mL培養液，靜置20 min，待細胞沈澱後記錄體積，再放回原培養瓶中繼續培養。以上試驗所使用的培養基，以1 N KOH或HCL將pH值調整為5.7±0.05後，經121℃，1.05 kg/cm2大氣壓高溫高壓消毒15 min。所有的細胞培養試驗，均以三角瓶培養，三角瓶置於轉速為100
rpm之旋轉式震盪器，培養於溫度為25±2℃之黑暗培養室。每個試驗都重複3次。(續二)

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http://www.seekbio.com/biotech/exp/Plants/2007/8215.html   紅豆杉屬於裸子植物，主要分佈於我國的雲南、四川、西藏和東北，是一類具有重要開發價值的樹木，它產生的紫杉醇通過臨床實驗被認為是最有希望的抗癌藥物。自然狀態下，紫杉醇的含量極低，僅佔樹皮乾重的十萬分之一，靠自然資源解決這一問題十分困難。同時由於自然狀態下紅豆杉生長速度很慢，過量的人工採伐，使野生資源受到了極大的破壞，在一些產地已面臨滅頂之災，保護其野生資源和擴大藥源已成為當前急需解決的矛盾。用播種育苗和扦插繁殖雖可在一定程度上緩解矛盾，但仍無法滿足需求，也不能從根本上解決問題。利用植物組織培養和細胞培養的方法來解決資源和藥源的矛盾，已成為國內外學者關注的問題。（一）材料較為適宜的組培外植體為新生的嫩枝，取材時間以每年的7、8月份為宜。（二）培養程序 1、癒傷組織誘導用培養基培養基的基本成分採用B5或MS的微量元素、有機物和鐵鹽，外加KNO3 2500m g/L,NH4NO3
825m g/L KH2PO4 、240mg/L,MgSO4· 7H2O 370m g/L,CaCl2·2H2O 660m g/L。添加的激素種類及數量為NAA 0.8 -1.0m g/L、 BA0.3 -0.5m g/L，調PH值為5.8-6.0；瓊脂粉和蔗糖用量分別為5.6 -6.0g /L和30g/L。配置好的培養基用培養瓶分裝，經高溫、高壓滅菌後備用。2、材料消毒與接種取新生的嫩枝（帶有針葉）放入加有0.02%洗潔精的自來水中浸泡10分鐘，浸泡過程中需經常攪動，浸泡結束後用自來水沖洗10分鐘以上。將嫩枝轉入一干淨的三角瓶中。以下所有操作必須在超淨工作台上進行無菌操作。首先往三角瓶中加入75%的酒精，加入量應為嫩枝體積的10倍以上，浸泡殺菌30-60秒，倒掉酒精，用無菌蒸餾水年漂洗一次；再將嫩枝轉入事先已高壓消毒的三角瓶中，加入15倍與嫩枝體積的0.1%的昇汞溶液，浸泡殺菌5-8分鐘，浸泡過程中要不斷搖動，以使昇汞與嫩枝充分接觸。為了達到徹底殺菌的效果，有人建議在昇汞溶液中加入0.02%的表面活性劑，這樣可能更好一些，但要相對縮短殺菌時間。倒掉昇汞溶液，用無菌蒸餾水沖洗4-6次，每次1-2分鐘，以徹底除去昇汞。將嫩枝從三角瓶中分批取出，用無菌濾紙吸去材料表面的水分，將嫩枝切成0.5 -0.8C M的小段，並切取部分針葉，嫩枝切段和針葉同時用作外植體，接種在誘導癒傷組織的培養基上。接種時要讓針葉的腹面接觸培養基，嫩枝的植物學近地端接觸培養基。注意用過的昇汞溶液和沖洗液不要到處亂倒，以防重金屬污染。將接種好的培養物放置於培養室中培養，溫度（25±2）℃，光照強度1500 -2000l x，光照時間10h/d。3、癒傷組織誘導  紅豆杉嫩枝和針葉在培養基上2-3週後即開始形成癒傷組織，約4-5週癒傷組織直徑可達1 -2C M。不同種的紅豆杉和不同的外植體之間形成癒傷組織的比率、時間早晚和生長速度存在明顯差異，南方紅豆杉和東北紅豆杉的嫩枝切段出愈較快，出愈率分別為89%和70%，針葉出愈較慢，出愈率也較低，分別為36%和15%；普通紅豆杉出愈較慢但出愈率較高，嫩枝和針葉的出愈率分別為94%和30%。癒傷組織開始時為灰白色，隨著癒傷組織的增大，先期形成的癒傷組織顏色由灰白色變為棕色，這可能預示著癒傷組織在逐漸發生褐變，因此要及時給予注意，盡量保持較低的培養溫度和經常更換培養基。當癒傷組織生長到一定大小時即可轉入液體進行懸浮培養。4、細胞懸浮培養與繼代利用癒傷組織而不是用小苗或大樹來生產提取紫杉醇，是一條正在探索的途徑，如果成功則可以實現工廠化生產，從根本上解決紅豆杉資源不足的矛盾。因此，通過嫩枝和針葉培養產生的癒傷組織不需要進行芽分化的誘導，而是將癒傷組織直接轉入細胞懸浮培養。具體做法是將從嫩枝和針葉上產生的癒傷組織取下來直接轉入液體培養基中進行（懸浮）振盪培養，所用培養基與上述誘導培養基相同。在初次將癒傷轉到液體培養基即可適當加入少量纖維素酶和果膠酶，以加快癒傷組織分離成單個細胞或小細胞團。在初次懸浮培養階段可用50ml的小三角瓶，每瓶加10ml液體培養基，放入癒傷組織，在20-23℃的搖床上振盪培養，光照條件與普通培養相同。每週需要更換一次培養基，更換時用5 -10m l的平頭移液管將三角瓶中的癒傷組織、單個細胞或細胞團過濾出來，直接轉到新鮮的培養基中即可。在懸浮培養過程中應隨時注意每一瓶中癒傷組織、細胞團生長的情況，挑選生長速度最快和特徵最好的作為繼代的材料，毫不可惜的丟掉那些不好的（生長緩慢、顏色不正等）材料，這樣經過幾代的選擇，就可以挑出符合理想的材料，作為懸浮系進行擴增培養。（三）紫杉醇含量的檢測
 現行的比較普遍有效的方法是利用薄層層析法，其大體過程是先將癒傷組織乾燥，再用甲醇滲濾提取，獲得提取液，經減壓濃縮至乾，用水：CHCl3取。合併CHCl3部分，再經減壓濃縮獲得粗提液，經薄層 ​​層析，收取喊紫杉醇和10-脫乙酰基巴卡丁-III的部分，再進行矽膠柱層析，分離收集相應流分，減壓濃縮，TLC再次檢測，將含有紫杉醇的濃縮液進行二次柱層析，鑑定結果。另外，紅豆杉癒傷組織經過一定分離提取後，可進行高效液相色譜層析（HPLC）分析，分析柱為4mm* 250m m的C18柱，dp=10μm，分離體係為甲醇-乙腈-水（20 ：33：47）等速洗脫，流速為1ml/min。關於紅豆杉植物組織細胞培養中褐化的問題是當前存在的一個重要問題，該現象與普通木本植物組培中出現的褐變不同。普通木本植物出現的褐變可通過選用較小的外植體、培養基中加活性炭、縮短繼代轉移週期、盡量少損傷外植體等措施加以克服，且以後不再發生。但是，利用上述方法解決紅豆杉的褐化問題收效甚微，這或許是因為紫杉醇本身對細胞生長具有毒害作用，其量的積累往往對細胞的增殖起抑製作用。如何解決提高細胞內紫杉醇的含量而又不給細胞的生長帶來很大影響，使二者相協調一致，是急需研究的課題。

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三、採穗部位與IBA 濃度對不同營養系插穗發根之影響在不同的插穗部位在發根情形與新梢生長情形各項調查中皆為半木質化插穗(下部)佳於綠枝(上部)，且為極顯著差異(p＜0.0001)。許博行(1985)對台灣紅豆杉之研究也是呈現半木質化插穗高於於綠枝的情形，而陳正豐(1989)對台灣杉(Taiwania cryptomerioides)扦插的研究則呈現插穗莖段之下段較上段為高的趨勢。Trueman and Peters (2006)曾比較瓦勒邁杉(Wollemia nobilis)其頂梢與下段之發根率，顯示下段的發根率(82.4 %)顯著高於頂梢(71.2 %)，原因是其下部的插穗有較大的葉面積與較粗壯的莖，可提供插穗較多的碳水化合物；此項結論與Puri and Verma (1996)對印度黃檀之研究頗有類同之處，其下段褐枝插穗之發根率、發根數、發根長度都顯著高於頂梢綠枝，說明了發根能力和插穗的生物量與提供碳水化合物之多寡有關；Palanisamy andKumar(1997)在印度楝樹中則發現，無論其枝條部位為何，直徑相同長度愈短者其發根率愈低，甚至無法發根，學者認為枝條太短者其生長激素、碳水化合物的或其它促進發根的物質含量都太少，以致無法發根；在Cordiaalliodora 的研究中，發根率是由基部向頂遞減，顯示其發根率是和插穗的生物量(長度、直徑)有關，即是和插穗採集前和採集後的培育期間之碳水化合物的累積有關(Mesen et al., 1997)。但何政坤等 (1998)在台灣紅豆杉以扦插苗(營養系N11(南庄)與T1(北橫))再扦插之研究中，卻顯示枝梢(88 %)之發根率顯著高於中段(64.1 %)，且枝梢之發根數也多於中段的情形，而Eccher (1988)對紅豆杉屬(Taxus spp.)植物的試驗亦是，此結果符合之前許多學者的研究，如Dick and Leakey(2006)、Kristiansen et al. (2005)、Almehdi et al. ( 2002)對櫻桃樹(Prunusavium)、Schlumbergera truncata、pistachio 的試驗，其發根率皆為由頂向基部遞減；除了發根率外，Dorycnium hirsutum (Alegre et al., 1998)插穗的發根數、最長根長、根域(rooting zone)也是頂梢高於中段的趨勢；由此可見發根能力除了與上述插穗本身之生物量與提供碳水化合物之情形有關外，還有其它因素，如生長激素的含量在頂梢最多，而其能促進形成層分裂誘導發根(楊冠政等，2000)；如在印度楝樹的研究中即發現，發根率由枝條頂梢向基部遞減，並認為因在植物體內生長激素的含量是隨著與頂端距離愈遠而愈低的(Palanisamy and Kumar, 1997)；不過Alegre et al. (1998)則指出Dorycnium pentaphyllum 的插穗部位對發根率、根數、最長根長、根域都沒有影響。本研究結果則以下段高於頂梢，與前述之頂梢高於下段的情形相異，除了上述原因外，推測也可能為營養系效應，本試驗中的營養系與插穗部位間的發根率、發根品質及新梢生長都呈顯著的交感效應，如W1 綠枝之最長根長、平均根長即優於半木質插穗而N2、N4、Z5 綠枝之新芽數與平均芽長之生長情形也比半木質化插穗佳，表示營養系間插穗發根能力並不相同。何政坤等(1998)曾以3000、5000、8000 ppm 的IBA 進行台灣紅豆杉扦插發根試驗，發現3000 ppm 是其中最佳的處理；而國外有些紅豆杉屬植物在2000 ppm 的IBA 濃度雖不會增加其發根的速度，但能提高扦插苗的發根率(Eccher, 1988)，本實驗以1,000、3,000 ppm 的IBA 與未施用IBA 之對照組進行比較，卻發現處理間的發根情形，包括發根率、發根數、最長根長、平均根長、側根率，甚至是新梢生長情形(抽芽數、平均芽長)都沒有顯著差異，類似情形在其它試驗中也曾出現，如Blythe et al. (2004)曾以IBA+NAA對Ficus benjamina 及Hedera
helix 利用生長激素運送的向基性(Skoog, 1938)進行葉面噴灑、底部快沾與未施用等三種不同處理進行生長激素對扦插苗的發根研究，發現其發根率、發根數、總發根長度、抽芽數在處理間並無顯著差異，顯示無使用生長激素的必要；同樣的IBA 對瓦勒邁杉的發根率、發根速率也沒有促進效果(Trueman and Peters, 2006)；Dorycnium hirsutum 的發根率、發根數、最長根長、根域在IBA 與控對照間也均無顯著差異(Alegreet al., 1998)；Ofore et al.(1996)在Milicia excelsa 的實驗，IBA 對發根的促進也沒有顯著的影響。施用生長激素對發根率、發根數沒有顯著影響的原因，可能與植體本身是否已產生足夠的內生荷爾蒙有關(Hartmann and Kester, 2002)，通常生長激素隨著年齡增長而降低；而本試驗所採用的枝條為8 年之營養系林木，以其它台灣紅豆杉實驗所使用老齡母樹之枝條而言，枝穗相對較幼，或許插穗本身之生長激素已足夠，以致另外施用IBA 並無顯著促進發根效果；在Negash(2002)對筆柏的研究中也發現，越老的枝條發根所需之IBA 濃度越高，越幼越低，甚至不需另外施用IBA，可以再次說明IBA 對幼枝的效用有限。事實上插穗之發根能力並不僅僅由生長激素所影響，還有其它因素，如各荷爾蒙間之交互作用(Tsipouridis et al., 2006；Krisantini et al., 2006)和樹齡(Negash, 2002)的效果，還有包括許多化學、物理、生化因子對發根效果的影響，如母樹生長的環境(Pellicer et al., 1998)、枝條的位置(上、中、下)、枝條在冠層的位置、枝條長度與直徑(Palanisamy et al., 1997)、葉面積(Kibbler et al., 2004；Tchoundjeu et al., 2004)、扦插採集後進行扦插時的處理，如營養 (Chee, 1995； Puri and Verma, 1996)、光度(Pellicer et al., 1998；Dick and Leakey, 2006)、水分(Lebude et al., 2004)、介質(Prat et al.,1998；Tchoundjeu et al., 2004；Kristiansen et al., 2005)、溫度(Alegre et al., 1998；Almehdi et al., 2002 )，或植物本身在生長的各種不同階段、季節之間的差異都會影響發根，如季節變化在光度、溫度、光週期、植物的生長可能改變內生生長激素(endogenous)的濃度，有些植物其植株內有較高的IAA 濃度的發根較佳(Ford et al., 2002)。IAA 是大多數植株內含量最豐沛的生長激素，IBA 是最近才發現於某些植株內的生長激素(Ludwig-Muller, 2000)，在許多實驗中，IBA 促進發根的效果優於IAA，不過還是依樹種而有差異，有關於IBA 對促進發根之顯著效果已有許多研究，如銀樺屬(Grevillea；Krisantini et al., 2006)、Aglaonemamodestum、Gardemia
augusta(Blythe et al., 2004)、育亨樹(JPausinystaliajohimbe；Tchoundjeu et al., 2004)、pistachio(Almehdi et al., 2002)、筆柏(Negash,2002)、Dorycnium
pentaphyllum ( Alegre et al., 1998)都能以IBA 提高其發根率、發根速率，甚至是發根數、發根長度；IBA 可以觸發根部的生長、分化，所以可以增加發根數，並因其可促使插穗較早發根(Aminah et al.,1995)，而使有插穗有時間發育較長的根長，發根數的多寡與發根長度對苗木十分重要，越多的根數的苗木越能提供插穗出栽後的固著力，亦越能有效吸收土壤中的水分與養分，生長較快也較有活力，其生物量增加也較為顯著(包括高度、扦插苗的分枝數、地際直徑)( Berhe et al., 1998；Negash,2002)。四、扦插季節對不同營養系插穗發根之影響以 5 個營養系( D1、D4、D9、Z3、Z4)分別於春( 2006/3/5 )、夏( 2006/8/14 )、冬( 2005/11/16 ) 3 個不同季節進行扦插繁殖之比較，結果顯示季節間的發根率、發根品質與新梢生長情形皆呈顯著差異，冬季之扦插苗生長情形明顯佳於春、夏兩季，無論是在發根率、總發根數、最長根長、側根率或是抽芽數與平均芽長皆為如此。本研究另以試驗一中發根率最高之5 個營養系(D4~D7、Z8)分別於夏( 2006/8/14 )、冬( 2005/11/16 )兩季進行扦插繁殖之比較，結果和上述季節實驗相同，各生長情形都以冬季為佳。一般而言，在新芽開始之數日至數週前，根群即急速開始生長(王子定，978)，通常根生長潛能在冬末春初時達到高峰，春天芽綻放後逐漸下降至夏天時最低(郭幸榮編，2006)。本試驗結果之發根率為冬＞春＞夏，因台灣紅豆杉扦插苗所需發根時間較長，大約於3 個月後才陸續發根，推測冬初扦插之苗木其發根時恰逢冬末春初之根系生長潛能高峰，而得到較佳的發根率，但季節和營養系間有交感效應，雖然在各項生長調查中呈現冬季優於春季，春季優於夏季的趨勢，但除了所有的苗木都在冬季表現為最佳之外，仍有夏季表現較佳於春季的苗木，如D4、Z3 之發根率、發根數皆為夏季較春季好；D1、D4、Z4 之新芽數與平均芽長也以是無此；顯示營養系發根能力的高低在季節間並不完全相同，營養系遺傳有所差異。類似的結果在Tsipouridis et al (2006)的桃樹栽培種( peach cultivars)中也可以看到，在12 個月中之扦插試驗中指出，其大約50 天後陸續發根，結果在10、11、2 月的發根率高於其它月份，且季節和品種有交感效應，並認為母樹營養生長的階段或和發根率有關，如插穗本身在冬季有較低的生長率( growth rate)、生化功能( biochemical functions)較低，所以會有較高的發根率，反之亦然，在高生長率時則發根率較低； Puri and Verma (1996)對印度黃檀的試驗中也顯示，根部生長活動在冬季活力較低，隨著溫度上升，碳水化合物與生長促進者(growtn promoters)的新陳代謝可使生長再度活躍，讓根部再度恢復生長；銀樺(Krisantini et al., 2006)在扦插3 週後即可開始發根，學者發現其季節間的高發根能力通常在和生長恢復與形成層活動度高時節相符。另外，檸檬香桃木(Kibbler et al., 2004)則在扦插8 週後陸續發根，單株間的發根率從0 %~100 %不等，且大部分的單株在春季的發根率比較高的，但也有在冬季得到較高發根率的單株，除了單株差異與生長活動的因素外，也可能和其插穗內檸檬醛(citral)濃度和環境因子複雜的交互作用有關(Kibbler et al., 2002)。植物進入休眠，或在葉、花掉落之之前都會將葉、花中的養分回收，轉移貯存至根部或莖部的組織中
(廖玉琬等譯， 2004)，以利來年植物生長所需，因此冬季所採集的穗條或許有較充足的養分以供扦插期間苗木所需，而得到較佳的發根率。陸、結論本研究就台灣紅豆杉不同之營養系依不同枝條部位、IBA 及扦插季節等處理進行扦插試驗。結果顯示不同營養系之間發根表現呈顯著差異，從0%~88 %差異極大，除發根率外，其它各項調查項目，包括發根數、最長根長、平均根長、側根率，甚至是新梢生長情形，如抽芽數、平均芽長等，也都有顯著差異，表示不同營養系的扦插成果有明顯的差異，其中D7 為發根能力最佳的營養系。由18 個營養系以綠枝、半木質化插穗及IBA 進行扦插比較，營養系間的發根率與發根品質及新梢生長情形仍呈顯著差異，且半木質化枝條發根與新梢生長情形皆優於綠枝，並與營養系呈顯著交感效應，但不同濃度的IBA 對促進發根並無顯著效果。以5 個營養系分別於春、夏、冬3 個不同季節進行扦插繁殖之比較，季節間的發根率、發根品質與新梢生長情形皆呈顯著差異，無論是在發根率、總發根數、最長根長、側根率或是抽芽數與平均芽長均以冬季之扦插苗生長情形明顯佳於春、夏兩季。在營養系間的發根率與發根品質及新梢生長情形仍呈顯著差異，且與季節有交感效應。健化試驗處理間的平均根長、最長根長呈顯著差異，顯示苗木出栽前減少灌水量並施肥能促進根部生長，改善耐旱能力。由本試驗中可以得知，台灣紅豆杉插穗營養系間發根率有很顯著差異，且與插穗部位、季節皆有交感效應，因此選擇的營養系十分重要，但若僅以發根率之強弱來作為營養系選擇之依據，並不適當，因其後續生長或其它性狀未必優良，優良營養系不僅僅是要發根快、發根率高，還希望它能擁有在低海拔生長快速、枝葉茂盛的特性，除此之外, 其枝葉還要含有高濃度的10-DAB，因此我們就高發根率最之3 營養系進行10-DAB 之分析，發現其中發根率最高之D7 當生年枝葉之10-DAB 濃度也最高，顯示其不僅是發根能力佳的營養系，也是擁有高產10-DAB 性狀之極優良營養系。雖然在夏季之扦插試驗中，D7 之綠枝發根率高為於半木質化枝條(60 %＞30.67 %)，在枝條採集上，通常綠枝的材料是較多的，所以如果能以綠枝進行扦插則可育出更多的扦插苗，但因為冬季並未對枝條部份進行測試，因此無法確知冬季之枝條部位的差異，但其整體表現為88 %，仍是高於夏季綠枝之發根率的，因此若能以10-DAB 含量濃度高且發根率佳之D7(不論枝條部位)在冬季進行扦插，無論在苗木發根情形與10-DAB 之收穫應都能得到最佳之培育效果。未來還需要更多出栽後生長調查與更進一步的枝葉紫杉烷類之分析，以篩選出優良營養系，甚至是未來對於優良營養系之認證、品種權的取得，都需要更多的營養系之相關資料，如其抽芽時節、株型特性，枝葉特殊成分，或者是分子分析等，以有效的培育與利用台灣紅豆杉。(END)

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四、扦插季節對不同營養系插穗發根之影響(一)扦插季節對不同營養系插穗發根之影響以 5 個營養系(D1、D4、D9、Z3、Z4)分別於冬( 2005/11/16 )、春( 2006/3/5 )、夏( 2006/8/14 )三個不同季節進行扦插繁殖之比較，苗木扦插8 個月後其在不同季節間發根情形及新梢生長之情形，季節間的發根率、發根品質與新梢生長情形皆呈顯著差異(表12)。冬季之扦插苗生長情形明顯佳於春、夏兩季，無論是在發根率、總發根數、最長根長、側根率或是抽芽數與平均芽長皆為如此。冬季扦插苗的發根率為40.40 %，佳於春、夏兩季(9.80 %, 9.47 %)(表13)，其它發根品質與新梢生長情形亦皆較春、夏佳，而春、夏兩季的根系與新梢的生長情形則都差不多。營養系間的生長情形，除發根數無顯著差異外，其餘的發根率與發根品質及新梢生長情形皆呈顯著差異(表12)，發根率、發根數與側根率最高者為D4(22.45 %, 1.98 支, 8.8 7%)(表13)， D1 則擁有最長的根長與平均根長( 13.93 mm , 10.01 mm )，而發根率與各項發根品質最差者都是Z3(2.83%, 0.55 支, 0.38 %, 1.95 mm , 0.38 mm )，在新梢生長情形方面，D1、D4 分別為抽芽數最高(2.08 支)與平均芽長最長( 17.77 mm )的營養系，D9 的新梢生長表現則最差(0.59 支, 7.42 mm )。從表 12 上可以得知季節與營養系在發根能力與新梢生長上皆有交感，雖然在各項生長調查中顯示冬季優於春季，春季優於夏季的趨勢，但除了所有的苗木都在冬季表現為最佳之外，仍有夏季表現較佳於春季的苗木，如D4、Z3 之發根率、發根數皆為夏季較春季好(附錄二)；Z3 之最長根長、平均根長也是如此；D1、D4、Z4 之新芽數與平均芽長也以夏季優於春季；表示扦插苗的發根能力不僅在季節、營養系上有所不同，也說明了季節對各營養系的效應並不相同。本研究另以試驗一(冬季)中高發根率之5 個營養系(D4~D7、Z8)於夏季( 2006/8/14 )進行扦插，以了解扦插季節對高發根率之營養系之影響。苗木扦插8 個月後其在季節間的發根率、發根品質與新梢生長情形皆呈顯著差異(表14)。結果和上述季節實驗相同，各生長情形都以冬季為佳(表15)，冬季扦插苗的發根率為74.80 %，夏季僅為24.53 %，冬季與夏季的總根數、最長根長、平均根長、與側根率以及新梢生長情形分為6.58 支, 56.79 mm , 33.20 mm , 62.00 %, 2.23 支, 24.03 mm；2.64 支, 14.40 mm , 9.37 mm , 10.53 % , 0.68 支, 4.14 mm (表15)，圖13 為冬、夏兩季發根率最高之5 個營養系的發根趨勢。從變異數分析上也可以得知這發根率最高之5 營養系間的發根與新梢生長情形仍呈顯著差異(表14)，發根率、發根數、側根率表現最優者皆D7(54.86 %, 6.99 支, 38.57 %)，D6 則為最長根長、平均根長最長者 ( 32.08 mm , 21.27 mm )，新梢生長情形則以D4 最佳(1.55 支, 10.46 mm )(表15)，而發根與新梢生長能力各項調查表現最差之營養系者皆Z8(11.43 %, 1.16 支, 8.31 mm , 3.77 mm , 8.57 %, 0.44 支, 4.54 mm )。除了發根率與發根數有交感效應(表14)外，其它發根情形與新芽數、平均芽長在季節與營養系間皆無交感效應。(二)扦插季節、採穗部位與IBA 濃度對不同營養系插穗發根之比較在春、夏兩季以不同的枝條部位、IBA 濃度進行扦插的統計分析結果，部位間的發根率、發根品質及新梢生長情形皆呈顯著差異(表16)，各生長情形都為半木質化枝條優於綠枝(表17)，半木質化枝條的發根率為13.49 %，綠枝僅為5.56 %，半木質化與綠枝的發根品質與新梢生長情形分為1.42 支, 9.69 mm , 6.79 mm , 4.6 %, 1.9 支, 13.75 mm；0.35 支, 3.52 mm , 2.76 mm ,
1.27 % , 1 支, 9.19 mm 。不同濃度的生長激素IBA 之二種處理(1,000/3,000 ppm)與一對照組在發根率與發根品質及新梢生長間並無顯著差異(表16)。在季節、營養系、插穗部位與IBA 濃度間的交感情形，從表16 可以得知，季節與插穗部位在發根率、發根數、側根率並沒有交感效應，但在根長與新梢生長則有交感，的營養系與插穗部位則在發根率、發根數有交感效應，如大致上來半木質化枝條的生長是比綠枝較佳，但D9 則是在兩部位皆沒有發根(附錄四)；在季節、營養系與插穗部位間卻與發根率、發根數有交感效應，其餘的根系與新梢生長情形都沒有交感情形存在，季節與IBA 在各項調查項目皆沒有交感，季節、插穗部位與IBA 亦是如此。

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(三)試驗設計試驗設計採裂區試驗設計(split plot design)，以營養系為主試因子，副試因子為綠枝與半木質化插穗2 種。此二種副試區再分別為施以含一對照組及二種IBA 濃度的3 種處理，每處理10-20 枝插穗，重複3-5 個區集，共用插穗7,200 支(表3)。四)調查方法於 2006 年3 月5 日於溫室進行扦插後14 週起每隔5 週分別觀察記錄發根情形至34 週為止。調查之進行依系統取樣法自處理小區從右方(五)統計分析每處理的發根率、側根率經反正弦角度轉換後進行統計分析。統計分析採用SAS 套裝軟體的GLM 程式進行變異數分析，如呈顯著，以最小顯著差異法(LSD)來檢定不同營養系間台灣紅豆杉不同採穗部位、IBA 處理之發根率、發根數、發根長度及側根率與抽芽數、平均芽長的差異性，顯著水準為5 %。四、扦插季節對不同營養系插穗發根之影響本試驗以信賢苗圃營養系園數種來源之營養系枝條於不同季節進行扦插，以比較不同扦插時期之各營養系間的發根率、發根品質與新梢生長。(一)插穗來源除試驗一(2005 年11 月16 日扦插，冬季)、試驗二(2006 年3 月5日扦插，春季)，另於2006 年8 月14 日(夏季)再取自林試所信賢苗圃內採集2 種源(中橫D、瑞岩Z) 9 個營養系各有1-6 株來源之枝條，枝穗先在福山植物園溫室噴霧系統設備下保存至隔日。(二)插穗處理隔日修取健壯長度為 10 -15 cm
之綠枝(Green shoot)與半木質化插穗(Semi- lignified shoot)，拔除基部3 cm 長度範圍的葉片，施以1,000ppm、3,000 ppm IBA 粉劑及未施IBA 之插穗為對照組。將插穗扦插於以泥炭土：蛭石：珍珠石＝1：1：1.5(v/v/v)之混合培養介質的84 孔穴盤內，枝穗扦插深度與噴霧管理同試驗(一)之方法。(三)試驗設計試驗設計採裂區試驗設計，以營養系為主試因子，副試因子為綠枝與半木質化插穗2 種。此二種副試區再分別為三種IBA 處理，每處理5支插穗，重複5 個區集，共計1,350 支(表4 )。(四)調查方法於 2006 年8 月15 日於溫室進行扦插14 週起每隔5 週分別觀察記錄每株苗木發根情形至34 週為止，其它調查方法同試驗(一)。(五)統計分析每處理的發根率、側根率經反正弦角度轉換進行統計分析。統計分析採用SAS 套裝軟體的GLM 程式進行變異數分析，如呈顯著，則以最小顯著差異法(LSD)來檢定不同扦插季節間各營養系台灣紅豆杉不同採穗部位、IBA 處理之發根率、發根數、發根長度及側根率與抽芽數、平均芽長的差異性，顯著水準為5 %。肆、結果一、不同營養系插穗發根之比較扦插 17 週後，每隔5 週分別觀察記錄14 個營養系其發根率(根長達到2 mm 以上始算發根)、發根數、發根長度及側根率與新梢生長情形，42週之統計值從表5 的變異數分析上可以得知營養系間的發根率、總根數、側根率則皆呈極顯著差異，即使是在同一種源內，營養系間的生長表現也不相同。表6 之發根率、總根數、側根率最者皆為D7 (88 %, 11.9 支,82 %)，最低者皆為D8 (12 %, 2.1 支, 8 %)；除此之外，抽芽數、平均芽長在營養系間也呈顯著差異，抽芽數、平均芽長最高者都是D1 (4.0 支, 26.2 mm )，最低者都是W8 (0.69 支, 9.2 mm )，很明顯的，營養系間根系與新梢生長情形並不相同；不過總根數、最長根長在營養系間則沒有顯著差異。同一種源內其營養系的發根結果也不相同，如D7 是本試驗中發根率最高者(88%)，而D8 卻是最低者(12%)，包括中國種源亦是如此，CH1 發根率為14%，CH2 卻高達70%。除此之外，營養系間其發根行為也有所不同，從圖9 可以看到實驗結束時(第42 週)發根率最高之6 個營養系的發根趨勢。從第17 週首次調查時，即發現營養系間的發根率有明顯差異，如D1 均未發根時D7 卻已高達60 %，但到第42 週時二者的發根率卻相差不多(D1：80%，D7：88%)，顯示營養系間其發根行為有所不同，且發根率約在第37 週(9 個月)時達到高峯，之後則持平，甚至有下降的趨勢。插穗發育之不定根大多在癒合組織處形成(圖10)，只有極少數例外，在實驗結束換盆時的13,750 株扦插苗中，僅發現三例除在癒合組織處形成不定根外，也從葉痕處發根。本研究中癒合組織形成的比例高達99.43 %。2006 年11 月22 日將發根率最高之3 營養系(D1, D5, D7)各405 株出栽至宜蘭大學大礁溪實驗林場8 個月後，採集當年生與一年生枝葉(圖11)進行10-DAB 的萃取與分析，結果顯示營養系與葉齡間的10-DAB 濃度皆呈極顯著差異(表7)，由表8 更可進一步瞭解D7 的10-DAB 含量無論是當年生或一年生者皆高於其它2 營養系，為5,350 ppm 與 4,691 ppm，而D1, D5 的10-DAB 濃度平均則在2,500~3,100 ppm 之間，且各營養系之10-DAB 濃度都呈現當生年高於一年生的趨勢，3 營養系的10-DAB 濃度的高低並恰巧的和其發根率的高低呈正比。二、扦插苗健化處理試驗以供水量減半並加以施肥進行 10 週的健化後，扦插苗的發根率與發根品質及新梢生長如表9，處理間的平均根長呈極顯著差異( p＜0.0001)，健化組為51.3 mm，而控制組為32.7 mm，健化組之平均根長約為控制組之1.6倍；處理間的最長根長也呈顯著差異( p＜0.05)，健化組之平均最長根長為72.7 mm，而控制組為63.8 mm；但在發根率、總根數、側根率、抽芽數及平均芽長上處理間並沒有顯著差異。三、採穗部位與IBA 濃度對不同營養系插穗發根之影響18 個營養系以綠枝、半木質化插穗二種不同插穗，施以含一對照組及二種IBA 濃度的三種處理(1,000/3,000 ppm)進行扦插，扦插14 週起，每隔5 週分別觀察記錄其發根率(根長達到2 mm 以上始算發根)、發根數、最長根長、發根長度及側根率與新梢生長情形(抽芽數、平均芽長)。營養系間的發根率與發根品質及新梢生長情形皆呈顯著差異(表10)，發根率、發根品質與側根率最佳者為N4 (44.44 %, 4.76 支, 39.56 mm , 24.90 m m ,27.78
%)，Z3、Z6 則完全沒有發根；抽芽數最高者亦為N4(3.51 支)，Z3 與Z6 雖然完全沒有發根卻有發芽，但生長狀況不佳，為營養系中抽芽數、平均芽長最低者(0.27 支, 1.80 mm )；平均芽長最長的營養系為W5 ( 20.84 mm )，W5 的平均芽長雖然最長，但發根率是除完全不發根的營養系(Z3、Z6 )之外最低的(0.67 %)，且也完全沒有側根發生(表11)；事實上 Z3、Z6 雖未發根但仍有抽芽與W5 發根率低卻有最長之芽情形相似，可知新芽實為水芽，係為插穗內原本積蓄之養分所抽發之芽，並非插穗發根生長活性之表現。以不同的枝條部位進行扦插的統計分析結果，部位間的發根率、發根品質及新梢生長情形也皆呈顯著差異，各生長情形都為半木質化枝條優於綠枝(表11)，半木質化枝條的發根率為20.51 %，綠枝僅為7.07%，半木質化與綠枝的發根品質與新梢生長情形分為1.93 支, 17.34 mm , 12.07 m m ,13.43
%,1.64 支, 13.77 mm；0.67 支, 5.73 mm , 3.92 mm , 2.53 % , 0.89 支, 9.17m m
(表11)；從圖12 可以看到，從第1 次調查(扦插後第3 個月)時，半木質化插穗的發根率即高於綠枝(2.94 %＞0.24 %)，隨著時間的增加，二種枝條的發根率差別越大，半木質化插穗的發根率很明顯的高於綠枝插穗。不同濃度的生長激素IBA 之二種處理(1,000/3,000 ppm)與一對照組在發根率與發根品質及新梢生長間並無顯著差異(表10)，從表11 上也很清楚的看到，在IBA 之間各調查項目的數字都十分接近。營養系與插穗部位間的發根率、發根品質及新梢生長都呈顯著的交感效應，雖然整體而言半木質化插穗的生長表現優於綠枝，但仍有綠枝較佳者，如W1 綠枝之最長根長、平均根長( 18.11m m ,
13.82m m )就佳於半木質化Green shootSemi-lignified shoot41表11 插穗部位、IBA 濃度對營養系插穗的發根率與發根品質及新梢生長比較插穗( 15.44 mm , 10.69 mm )；而N2、N4、Z5 綠枝之新芽數與平均芽長(2.26支, 25.91 mm；4.74 支, 19.86 mm；2.44 支, 15.77 mm ) (附錄一)之生長情形也比半木質化插穗(2.26 支, 25.91 mm；4.74 支, 19.86 mm；2.44 支, 15.77 mm )佳；除此之外，也有兩者生長表現相同者，如Z7 兩不同枝條部位的發根率、發根率皆相同，Z3、Z6 則兩者皆無發根。而插穗部位與IBA、營養系與IBA、營養系與插穗部位及IBA 則無顯著交感效應(表10)。(續六)

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三、不同營養系插穗發根之比較本試驗以信賢苗圃營養系園數種來源之營養系枝條進行扦插，以比較各營養系間的發根率、發根品質與新梢生長。(一)插穗來源本試驗於 2005 年

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4、插穗繁殖的物理環境  (1)儲藏處理對於菊花插穗，如在扦插前能給予適當溫度、日數的儲藏處理，將可促進根形成，縮短發根過程可縮短插穗在苗床育苗時間，在大量繁殖時，並可提高苗床使用率，增加單位時間內育苗數量(張致盛與黃勝忠，1995)。但由於插穗在儲藏期其碳水化合物含量與儲藏溫度與時期長短呈現負相關，隨儲藏溫度之提高與期間增長會降低其含量，因此如何調整適當儲藏溫度及期間是相當重要的。菊花插穗自莖頂取下時，以石蠟切片觀察，莖組織內並無根原體存在，但經儲藏處理後，維管束周邊薄壁細胞束間形成層(interfascular cambium)部位即已開始根原體之分化，而根原體在扦插後繼續發育，凸出莖表皮發育成不定根。黃秀芳品種經儲藏4 天及7 天後根數較多根長較長，但經儲藏10 天後發根數減少，不同處理溫度間對其發根並無差異；黃精進品種在儲藏4 天及7 天與12 及15 度C 之處理根數較多，儲藏10 天及18 0C 之處理減少發根數，但根長度較長(張致盛與黃勝忠，1995)；由於菊花幼苗須具備相當短及苗床育苗效率之關鍵。(2)插穗葉面積(leaf
area)葉為生長激素與碳水化合物的來源，葉面積關係到植物本身製造生長激素與碳水化合物的能力，當然也影響到蒸散率。各樹種製造生長激素、碳水化合物的能力與蒸散率各不相同，其最適葉面積也不相同，如在Milicia excelsa 中，發根率與葉面積(0, 10, 20, 40, 60 c m 2)大成正相關，但與葉面積20, 40, 60 c m 2
之間並無顯著差異，不過在發根數上，60 cm2 則比40 cm2 稍低，所以40 cm2 其最適葉面積(Ofore etal., 1996)。另一方面，葉面積愈小者，其抽新芽的比例愈高，則發根率愈低，葉面積大小也和死亡率成負相關。無葉的插穗的發根率非常低，有些樹種甚至幾乎無法發根，而能發根的無葉插穗的可能原因是其在剪下之前已儲存了足夠的養分。(3)發根介質合適的介質除了能固定插條外，還能供給植物理想的水分並有良好的通氣性，提供足夠的氧氣量以利根部呼吸所需。但每個樹種對水分、空氣的條件不同，對介質的要求也就不同，適當與否通常視該樹種是屬耐濕種(hydromorphic)還是耐旱種(xeromorphic)，如Milicia
excelsa 在保水性較高的木屑能得到最佳的發根率(Ofore et al., 1996)，但Cordiaalliodora 卻是在礫石中的發根率最高(Mesen et al., 1997)。一般而言通常介質若有較高的保水性(如木屑)則能提供插穗較多的水分， 進而增加其氣孔傳導度(stomatalconductances, gs)與光合作用速率以提高發根率；葉部含水量低，其發根率、地下部生物量都較低，這又強調了介質保水力重要性(Ofore et al., 1996)，尤其是對無法耐旱的樹種而言，介質可提供足夠的水分是十分重要的，其也可使該樹種在枝葉被剪取下來時，所面臨的突發嚴重水分喪失狀況得到迅速的補充。事實上介質不僅僅關係發根率，在發根品質上也有影響，如Eccher (1988)在紅豆杉屬以沙與泥炭土之混合介質及珍珠石兩種培養介質的試驗中發現，雖然發根率並沒有顯著差異，但在混合介質中所發育的不定根較為纖細、強韌且有較多的側根。(4)環境因子控制光合作用在插穗是透過葉片來影響不定根的形成(Mesen et al., 1997)，通常來說，生物量的增加會關係到發根的能力，這或許也和插穗被剪下之前所累積的生物量也有關。而光度對插穗發根的影響在每個樹種間並不相同，如白楊、柳樹就喜歡高光度，而光度對歐洲赤松(Pinus
sylvestris)的發根則不太有影響。Palanisamy and Kumar(1997)研究印度楝樹中發現，其實驗光度為戶外(1932 μmol m-2s-1)＞溫室(135 μmol m-2s-1)＞蔭棚(120 μmol m-2s-1)，其它的水分、濕度、溫度都相似，最後發根率則是溫室(77 %)＞蔭棚(66 %)＞戶外(12 %)，雖然印度楝樹是適合低光度的，但在本實驗中溫室的光度雖稍高於蔭棚，但發根率卻略高於蔭棚，原因可能是溫室內濕度較高(蔭棚濕度最高66 %，最低11 %；溫室濕度最高70 %，最低65 %)，由此可見濕度對插穗發根的影響性。在非噴霧式繁殖系統(Non-mist propagator system)內，光合作用有效輻射(photosynthetically active radiation, PAR)昇高時，葉-空氣蒸氣壓差(leaf-air vapour pressure deficit,VPD)與葉部缺水(water deficits)的狀況也隨之增加(Mesen etal., 1997)，即VPD 和PAR 呈正相關，在光度增強時高，蒸散率也提高，使水逆差變大，而PAR 和光合作用速率(photosynthetic rates, Pn)也呈正相關，所以環境的光度、濕度間的平衡很重要，如能使用蔭棚以保持低VPD 的同時，又允許足夠的光度使苗木累積生物量(Mesen et al., 1997)則為最理想的狀態。中國東北紅豆杉(日本紫杉)適合扦插發根的溫度是18oC~27 oC (柏廣新等，2002)；Eccher (1988)20oC、23oC及26oC 的苗床溫度進行英國紅豆杉、中國東北紅豆杉與曼地亞紅豆杉等16 個栽培品種之扦插試驗，結果顯示除了T.cuspidata cv. Thayerae, T. baccata cvs Barroni, Fastigiata 及Fastigiata robusta 外，其它都是在20oC 時較快發根。5、插穗繁殖的化學環境(1)浸泡高錳酸鉀(potassium permanganate)溶液台灣紅豆杉插穗扦插前經高錳酸鉀溶液浸泡後可促進發根(許博行，1984)，可能是因為插穗內具有抑制發根之物質(如激勃素，gibberellins, GAs)被高錳酸鉀去除或減低濃度，或是因為插穗內之酚類化合物與高錳酸鉀作用，形成另一種生成物後，而不具有抑制作用。因為，某些酚類化合物在插穗發根的過程中具促進效果，某些則反具抑制現象，即使是同一種類亦因濃度之不同而改變其抑制效應，所以推論酚類化合物之濃度或種類的改變乃是促進台灣紅豆杉插穗發根的原因。高錳酸鉀溶液也可提高插穗癒合組織的形成(許博行，1984)，癒合組織為一保護組織，在插穗未發根前，一方面可保護插穗之切面免遭細菌感染而腐爛，另一方面可透過癒合組織的細胞吸收介質之水分供插穗使用，以保持插穗未發根前之成活(Hartmann and Kester, 2002)。因此癒合組織之形成對插穗之發根有間接效益。一般而言，癒合組織良好者，插穗之發根率亦較高，尤是發根困難之樹種，癒合組織之形成扮演一重要角色(許博行，1984)。(2)施用生長激素(auxin)生長激素在各樹種的效用變異很大，從完全無效到有極大的效用的情形都有(Ofore et al., 1996)，許多研究中都發現施用生長激素能加速插穗的發根速率，增加發根數與最終的發根率，甚至將生長激素直接注射白梧桐( Triplochitonscleroxylon）母樹的木質部後，都能提高從該樹採下插穗的發根率(Leakey, 1993)。生長激素是最早發現之植物生長調節劑，1926 年由Want 證明此成分的存在及其作用。在自然界中，生長激素的作用包括促進植物細胞生長，誘導細胞分裂及分化、促進發根、抑制葉、花、果實脫落、控制開花與結果等(李學勇，1985)。IAA (吲哚乙酸，indole-3-acetic acid)為植物體內第一個內分離出來的生長激素，較易受光氧化分解或受高溫影響而減低或喪失其作用(林志謀，1996)，通常在細胞分裂旺盛的生長點部位最濃度最高，其餘部分只有少量存在。生長激素在木本插穗的發根過程中扮演著舉足輕重的角色(Ofore et al., 1996)，早期使用IAA 來促進發根，後換以效果更高的人工合成生長激素，目前已有多種之生長激素被使用，如IBA(吲哚丁酸，Indole butyric acid)、NAA(α-萘乙酸，α-naphthalene acetic acid)、2,4-D(2,4-雙氯酚醋酸，2,4-dichlorophenoxy acetic acid)等，其中因IBA 性質較穩定、不易被植物酵素分解、停留在處理部位的時間長、在一寬廣之濃度對植物之毒害亦較低、且適用於多種植物，為最佳的發根促進劑
(郭幸榮與林季櫻，1986；Hartmann andKester, 2002)。IBA 可刺激形成層的活動和根原細胞的分化與伸長，而提高發根率。Mitchell (1997)在太平洋紫杉與英國紅豆杉的研究中也證實，IBA 可以增加其發根率；在其它許多研究中也發現在添加不同種類的生長激素中，皆以IBA 的效果最佳(溫英杰，2003；Tchoundjeu et al., 2004)。但施用IBA 的最適劑量依不同的樹種有很大差異，如Eccher (1988)將紅豆杉屬植物以0、1,000 與2,000 ppm 來試驗時，發現2,000 ppm 為其最適濃度，不僅可提高其發根率，也能增加其發根的速度；白梧桐為4,000 ppm，這都和Cordiaalliodora
的最適濃度16,000 ppm 差別很大(Mesen et al.,1997)。但要注意的是IBA 濃度太高反而會抑制發根(Aminah et al., 1995；Mesen et al., 1997)，甚至在植物組織內長期保持過高的生長激素會造成細胞死亡(Ofore et al.,1996)。IBA 對不同樹種的致死濃度有很大的不同(Hartmannand Kester, 2002)，一般過高的IBA 劑量造成的死亡率高達10-17 %，但深紅柳桉(Shorea
macrophylla)在即使在高達10,800 ppm 的IBA 時，死亡率也只有11 %，所以對不同的樹種，其合適濃度差別很大，施用對該樹種適當濃度的生長激素是非常重要的(王子定，1978)。6、插穗繁殖的生物環境農桿根群菌(Agrobacterium rhizogenes)是一種土壤中的細菌，會誘使許多草本植物如紅蘿蔔、地瓜、大豆及人蔘產生數量龐大的毛狀根群，阻礙莖部及球莖的發展，而被視為病原菌，但對於多年生木本來說，農桿根群菌並不被視為病原菌，反而有促進根莖生長的效果(Strobel and Nachmias, 1985)。農桿根群菌的感染有助於許多難發根的樹種發根(Bassil et al.,1 991)，主要是因為農桿根群菌除了可促進插穗提早發根、提高發根率外，其所誘導出的根，其型態和正常根相似，且因其可提高發根數目，促進根系的生長，能使台灣紅豆杉有80 % 以上的發根率(陳國峰等，2003)。然不同扦插季節也會影響接種農桿根群菌促進發根的效果，如陳國峰等(2003)台灣紅豆杉插穗實驗中，第一次發根試驗正當冬季氣溫較低時，不利農桿根菌的生長，加上插穗正處休眠的生理階段，使轉殖效率較差，因此接種插穗發根率表現較差；第二次試驗扦插氣溫約在20-25 0C 間，插穗尚未進入休眠階段，正適農桿根群菌的轉殖，故接種菌種插穗的促進效果較佳，何政坤等(2000)利用農桿根菌接種台灣紅豆杉插穗，也顯示秋季接種比夏季接種更能提高發根率及發根數，推測夏季溫度較高，不利農桿根菌生長與基因之轉殖。參、材料與方法一、試驗地概述本研究四個扦插試驗皆於林業試驗所之福山植物園溫室(圖1)內進行，所培育之苗木則出栽至宜蘭大學大礁溪實驗林場，以建立實驗式採穗園區。(一)林業試驗所福山植物園溫室試驗福山試驗林位於北緯 24o 46’，東經121o 34’，介於台北縣烏來鄉與宜蘭縣員山鄉的交界處，全區面積1,097.9 ha，海拔高度範圍為400~ 1,400 m，但以600 ~ 800 m 為主。根據福山苗圃氣象觀測站的資料，2006 年的年平均溫為18.78 oC，最冷月均溫為1 月的13.88 oC，最暖月均溫為7 月的26.58 oC，平均年雨量為3723 mm，年相對濕度達91.77 %。(二)宜蘭大學大礁溪實驗林場實驗林場則位於宜蘭縣礁溪鄉二結村山區，年降雨量可達 2700mm 以上，年降雨日在200 日以上。此實驗式採穗園區原為林木稀疏之灌草叢林地，於2005 年11 月清理灌草叢並疏開林分，依地形整治為水平橫坡小平台階段，平台寬約1.5 -2 m，面積約0.5 ha，地面舖覆遮草布。二、插穗來源試驗材料來自林業試驗所位於台北縣烏來鄉信賢苗圃內之 8 年生台灣紅豆杉營養系園，園內苗木源於1994 年由林業試驗所簡慶德博士採自不同種源之天然母樹，隔年種子發芽成苗後，選拔生長表現最佳的前10 株苗木復於1997 年時進行扦插，1998 年在台北溫室培育2 年後，於2000 年時在信賢苗圃建立營養系試驗區，園區內另有引自中國大陸之中國紅豆杉種源，其培育方式、時期與選拔法同台灣紅豆杉。(續四)

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