生物反應器動植物細胞罐提供從實驗室2.5L罐到大規模生產35KL罐的一系列設備，並可根據用戶需要提供特殊要求的生物反應器公司曾經為某美國製藥企業提供35KL的紅豆衫細胞生產線，生產線通過美國FDA認證，為目前唯一通過FDA認證的生產紫杉醇的細胞生產線。
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結果與討論一、不同細胞系的生長速率與紫杉醇含量比較將五個不同來源的細胞系(A-E)，以100 g·FW/L細胞接種密度培養於含NAA或2,4-D的培養基，所選用的植物生長素與濃度，是依據先前癒合組織生長結果最好的培養基修正而來(Chang et al. 1996)。培養21 d後測量細胞鮮重，發現細胞系間生長速率呈現明顯差異(Fig. 2)。以細胞系A與B生長率最好，鮮重可增加4.5~4.8倍，細胞系E生長最差，最高只增加1.3倍。對生長最佳的3個細胞系而言，培養基以含有5 mg/L 2,4-D時生長最好。觀察培養液，發現細胞系A培養液呈透明，細胞為白色，顯微鏡下為單一細胞；其他細胞系的培養液與細胞都呈淡棕色，除了細胞系B的細胞會長大成為瘤狀的顆粒狀以外，其他3個細胞系之大部分細胞呈單細胞狀，偶有一些由25個細胞以下聚集的
分析taxane在細胞與培養基的分佈情形，發現4個可生產taxane的細胞系(細胞系B-E)，其80%以上的DB與BC會釋於培養基中，而紫杉醇則相反，80%以上的紫杉醇都保存在細胞中。DB與BC兩種taxane在不同紅豆杉樹種之細胞培養的結果都蠻一致的，即絕大部分都會釋出細胞而存在於培養基中；而紫杉醇則依細胞系而異，如T.
baccata (Hirasuna et al. 1996)、與T.
canadensis有90%以上的紫杉醇會釋出於培養基中(Ketchum
et al. 1999)，T. cuspidata的細胞培養則不同研究有些差異，分別報告紫杉醇有66% (Fett-Neto
et al. 1994)或90%以上(Ketchum
et al. 1999)會釋出於培養基，T. chinensis細胞培養，只有10-25%的紫杉醇會釋出於培養基(Wang
et al. 1997, 2001)，而T. x media細胞的紫杉醇只有很少量或完全不會釋出於培養基，而是保存在細胞中(Wickremesinhe
and Arteca 1994)。
比較細胞生長與紫杉醇生產發現，細胞系A生長最好，細胞培養也完全沒有褐化問題，但卻沒有任何紫杉烷類物生產。細胞系C與E的生長差且紫杉醇含量亦低。細胞系B的生長佳且taxane產量也高，細胞培養會形成大小不一的瘤狀細胞團，最大的直徑可達3 -4 mm
(Fig. 4)。瘤狀細胞團在其他的紅豆杉細胞也有報導，一般認為以瘤狀細胞團來生產紫杉醇可能比完全未分化的細胞穩定(Ellis et al. 1996)。而細胞系D的生長雖不是最快，但taxane與DB，BC含量均為五個細胞系中最高，可做為最佳用以生產紫杉醇的細胞系。因此，細胞系B與D兩個細胞系值得進一步培養並監測其長期培養紫杉醇生產的穩定性。二、細胞培養接種起始密度對生長的影響台灣紅豆杉細胞系D以不同細胞起始密度培養於WN培養基，以具側管之三角瓶培養並測量其沈降體積比(Fig.
1)及細胞之鮮乾重作為生長速率之指標。不論以體積、鮮重或乾重為指標，細胞的生長都以起始密度為100 g·FW/L
(=1/10 (w/v))最佳(Figs. 5, 6)，培養24 d後，細胞之生長量可增加3-3.5倍，此時細胞體積可達總培養體積的48.3%。起始密度50 -75 g /L之培養組的細胞生長量可增加2-2.6倍。在更高或更低之起始密度的試驗組，細胞生長較差，尤其是在低細胞密度者，細胞生長受阻，培養24天生長量只增加0.3-0.8倍。此結果與T. media的細胞培養試驗近似，其細胞生長以接種密度為80 -110 g ·FW/L最佳，密度若低於50 g·FW/L則生長嚴重受阻(Wickremesinhe and
Arteca 1994)。在T. chinensis的細胞接種試驗也有相似的結果，當細胞以18 -75 g ·FW/L之起始密度培養，發現在密度為75 g·FW/L時，細胞生長最佳(Wang et al. 1997)。至於細胞密度過高導致生長變差，推測可能原因，是細胞數量過多導致養份不足以充分供應細胞所需所致。
細胞培養之細胞量加倍時間(doubling time)，一般以體積、鮮重或乾重來表示，為了不干擾細胞生長，我們以體積來計算(Fig. 5)。在本試驗所採用之接種密度條件下，生長曲線並無明顯之潛蟄期(latent phase)，細胞加倍時間受細胞培養之起始密度影響，起始密度介於50 -100 g ·FW/L時，細胞的生長最快，細胞加倍時間約發生於培養的第6
d (Fig. 5)。其次為密度150 g·FW/L之培養，細胞量加倍需時9 d，而密度為25 g·FW/L與200 g·FW/L之細胞培養，到試驗結束的第24 d，細胞量仍未加倍。有關紅豆杉細胞培養，雖然所用以計算細胞加倍時間的方法並不同，但除了少數在6 d以下外，大都在發生在14-20 d之間(Wickremesinhe and Arteca 1994, Fetto-Neto et al. 1995,
Jaziri et al. 1996, Phisalaphong and Linden
1999)。因此，台灣紅豆杉細胞系D的生長速率並不亞於其他種類的紅豆杉細胞。以顯微鏡觀察，細胞系D培養液內有許多8-25個細胞組合在一起的團聚細胞，但大部分為單一細胞。培養液的顏色在起始密度低於100 g·FW/L時多為淡棕色，若密度超過100 g·FW/L，則培養液的顏色變深，尤其是200 g·FW/L的培養液多呈黃褐色至深褐色(Fig. 7)。三、不同新舊培養液比例對繼代培養細胞生長之影響將細胞系D以50 -150 g ·FW/L之接種密度配合不同比例之新、舊培養基，培養21
d，發現
細胞密度、舊培養液(細胞加舊培養基)與新培養基比例會影響細胞生長與培養液顏色(Table 1)。新培養基過多會導致培養液與細胞變紅色且細胞生長受阻，尤其在完全不添加舊培養基的狀況下最為嚴重，而此現象與細胞密度無關。一般而言，細胞密度低(50 -100 g ·FW/L)時，舊與新培養液之比例在3:7-5:5，細胞生長最佳且培養液也不會有變紅或轉褐的現象產生。提高細胞密度( 150 g ·FW/L)時，所需的新培養液較多，細胞生長最佳的舊與新培養液比例為3:7~4:6，且當舊與新培養液比例為4:6~5:5時，培養液就會有褐化現象產生，可能因為細胞密度高，需要較多的新鮮培養基。紅豆杉屬植物組織與細胞培養的褐化問題一直無法完全解決，在細胞培養常觀察到的培養基或細胞變紅或變褐的現象即為細胞褐化所產生，一般認為可能為酚類化合物氧化所產生，此現象會導致細胞死亡(Fett-Neto
et al. 1994, Wickremesinhe and Areca, 1994, Wang et al. 2001)。Wickremesinhe和Arteca
(1994)發現在培養基中添加1% PVP10並不會減輕紅色分泌物的產生，但會使細胞活著且繼續生長。在我們的試驗中發現，控制繼代培養時細胞的密度與新舊培養基比例，可以避免細胞培養產生褐化現象，而使細胞快速生長。
四、細胞連續培養方法之建立細胞系D以1
L三角瓶進行不同接種密度之連續培養，在培養期間的第15，30與45
d，更換培養基；於前兩次分別以150 mL新培養基更換等量之舊培養基，而第三只更換100 mL舊培養基，培養60
d後測量細胞生產量，結果顯示在此系統下培養的細胞可一直生長(Fig. 8)。在細胞起始密度為50 -75 g ·FW/L之培養組，最後的細胞體積可達總培養體積的61-63%，且培養液的顏色都可維持在淡棕色。以細胞體積增加比例而言，細胞起始密度為25 g·FW/L鮮重的培養，雖然培養初期，由於細胞數少，所以第一次繼代培養前，細胞只增加了41%，但第二次繼代培養後，細胞即快速生長，培養60
d後，細胞體積可由原來的3.15%增加為39.3%，共增加了11.5倍為最多，且由於此時之細胞體積只有總體積的39%，所以推測若繼續培養仍有生長空間。起始密度為50 g·FW/L之實驗組，培養60天後之細胞可增加10.7倍；增殖比最差的是細胞接種密度為75 g·FW/L的培養組，細胞體積只增加了7.62倍。與前述定積培養結果相比較，發現定積培養時，接種密度為培養的限制因子，低細胞接種密度下培養24
d，細胞生長少，而以連續培養方式卻以低接種密度之細胞生長量增加的倍率最高，似乎相矛盾。事實上連續培養在培養的前30
d細胞生長量也是很低，但由於每15 d更換添加新培養基，所以細胞生長雖緩慢仍較定積培養為佳，到培養30
d後，細胞密度已約達75
g·FW/L左右，加上新鮮培養基的刺激，細胞即開始呈現快速生長。
一般細胞培養都是採用定積培養(batch
culture)，即細胞培養於固定容積的培養基中，細胞分裂及生長而增加生物量，直到培養環境(營養或氧氣等)成為限制因子。而連續性培養，則是在細胞培養過程中加入新鮮培養基，並平衡收集舊培養基(Street
1979)。定積培養時，約每10-14 d左右進行一次繼代培養以維持細胞生長活力，繼代培養時將原來的母瓶分成2-5瓶，再加入新鮮培養基，進行新的培養(Ketchum
and Gibson 1996, Mirjalili and Linden 1996)。以此方式培養細胞，需要很多的震盪器，且幾次繼代下來，每一瓶的細胞差異變大，基於最後細胞培養將放大以生物反應器來培養，屆時需要數瓶三角瓶的細胞一起加入生物反應器，為減少細胞變異，且降低培養空間，同時生物反應器培養細胞一般亦是以連續培養方式進行，因此我們發展以1 L三角瓶的連續培養台灣紅豆杉細胞方法，結果也確實顯示，在此系統下培養了2個月的細胞均可維持良好的生長狀態。結論利用紅豆杉細胞培養方法生產紫杉醇，其成功的主要關鍵，一般認為首在細胞篩選，最好的細胞系應具備生長快速且紫杉醇含量高的特性(Zhong 1995, Hirasuna et al. 1996, Ketchum et al. 1996)。另外，Hirasuna et al.
(1996)認為紫杉醇的合成過程對環境的變化很敏感，產量會受培養條件之輕微改變的影響，所以培養時的各種條件因子，如細胞之起始密度、培養基組成、繼代時間和溫度等都必須嚴格控制。此外，生長素對長期之細胞培養來生產二次代謝物的穩定性影響(Ketchum and Gibson 1996)也是重要關鍵之一，唯有有效掌控這些基本細胞之培養條件，再加上後續的紫杉醇誘導與生物
反應器放大試驗，才能成功的利用細胞培養生產紫杉醇(Zhong
1995)。在本試驗中，我們建立台灣紅豆杉細胞培養方法，包括最佳的細胞接種密度、培養基組成、繼代培養與連續培養方法，對紅豆杉細胞培養常會產生的紅色或褐色分泌物(褐化)問題，提出解決辦法，也發現不同細胞系間的taxane含量存在很大的差異，目前選出細胞增生率與taxane生產都很高的細胞系B與D。未來將繼續培養與篩選具更高生產taxane能力的細胞系，並進行紫杉醇增產試驗與生物反應器放大之培養試驗，以期利用台灣紅豆杉細胞培養方式達到商業化生產紫杉醇的目的。
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http://www.itri.org.tw/chi/tech-transfer/04.asp?NodeId=041&RootNodeId=040&id=2430
生醫與醫材可移轉技術 技 術 簡 介本技術為針對紅豆杉細胞培養生產紅豆杉醇（Taxol）所發展的紅豆杉醇分離純化技術，製程包含破碎、萃取、濃縮、層析與結晶╱再結晶。純度可達98%，回收率可達50%以上。技 術 特 色 本技術是目前已知從紅豆杉細胞培養液純化生產紅豆杉醇技術中最簡單的製程，具高回收率。應 用 範 圍紅豆杉細胞培養液中紅豆杉醇的分離純化，亦可用在BaccatinⅢ的分離純化或其它taxane類的分離純化(只限於植物組織培養製程)。接 受 技 術 者 具 備 基 礎 建 議 (設備)細胞培養設備(反應器)。接 受 技 術 者 具 備 基 礎 建 議 (專業)培養植物細胞、純化、分離技術。
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