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  • 10月 29 週二 201309:27
  • 金線蓮:農業的傳奇作物 !!



金線蓮:農業的傳奇作物       中興大學農機系-------陳加忠
 在台灣所有的農產品中,金線蓮是屬於最傳奇的作物,傳奇的內容不僅包括它的藥效,還包括它的售價與栽培方式。個人在花卉栽培自動化技術的推廣過程中,常常遇見如下的問題1.金線蓮要如何種植?2.台灣能在平地種出金線蓮?為了解答這些問題,因此參預民間的試驗研究。此篇文章之目的在於以栽培方式與產業的觀點加以討論此項傳奇作物。金線蓮的栽培 在民間傳說中,金線蓮號稱藥王,能治百病。在報紙的新聞報導下,這種草藥被形容成可以抗癌,可治療肝病、高血壓、心臟病、糖尿病等種種疾病。而其售價也有不同的報導。鮮物價格自每台斤3000元至5000元,因而被形容為比人參昂貴的農作物。在台灣農業不景氣的時代,金線蓮為許多農民寄以希望的作物。試想,一年若有200台斤的產量,全年收入則高達60萬至100萬,實在找不到比這種作物利潤更高的農產品了。因此在兩三年前幾乎在多數的設施內,都可以看到數盤至數十盤金線蓮加試種,而國近兩百家的組織培養苗生產者,幾乎有一半以上的業者都參預了金線蓮組培苗的生產。許多組培業者同時擔任販賣瓶苗和收購成株的角色。 金線蓮的生產可分為組培苗和植株設施栽培。組培苗繁殖技術在國內研究單位與業者不斷的研發努力之下,已經是成熟的技術。規模較大的組培業者,甚至已建立種苗源庫,自行留種而維持母瓶。由於金線蓮組培苗之母瓶主要來自種子之實生苗,因此組培苗業者除了在栽培場選育成長良好的植株也努力於深山內採集野生金線蓮持續自行留種。除了品種之外,如培養基的配方各組培場亦有其獨到之處。然而培養所處的環境卻少有在空調設備的栽培室內進行,主要在於各種自然環境的設施中進行,而設施僅有遮蔭網與風扇環控設備。設備較完善的組培苗栽培場則有利用水牆與風扇,在夏天使溫室內溫度低於外界溫度。國內政府編列之推廣刊物:(農民淺說)有如下敘述:“組織培養之環境:一般金線蓮多培養在溫度22±1℃,若超過25℃以上,在瓶內發育不良,基至褐化死亡”。以國內金線蓮各組培苗場實地量測結果,夏天瓶內溫度常有高達30℃以上之情況,而瓶苗仍然茁長健壯,由此可知民間業者之組培苗生產技術,己超越了政府推廣刊物之描述。然而以目前之組培苗生產技術,仍有許多改善空間,例如縮短瓶苗生長期間,提高瓶苗的生長整齊度等。組培苗在瓶內經過馴化後,種植於設施內之栽培技術對於一般栽培者是極大的挑戰。例如成長慢。病蟲害多,存活率低,成株重量不足等,這些問題造成了在栽培過程不易成功。而且國內相關之技術資料不多,種苗繁殖場於“豐年月刊“,花蓮農改場於”花蓮區農技報導“各有一篇推廣報導,其他學術刊物如”科學農業”,“中華農學研究”也有些學術性的文章。民間則已出版售價高達兩仟元的巨書“金線蓮繁殖技術”。這些文章與資料,尚未對於金線蓮栽培提供完整資訊,以改良場之資料為例,對栽培環境與利用之設施建議內容摘錄如下:(一) 、栽培環境:光線為3000--5000lux,溫度在25℃以上氣溫下生長停頓甚至枯萎,最適宜的溫度是15-20℃。最適宜之相對濕度為75-85%。(二) 、栽培場以遮蔭網之設施為主為溫網室(防雨網室)高2.5-3.0公尺之屋頂,屋頂上下1公尺為遮蔭網。栽培場地在平地,可在地面挖淺溝或以磚塊圍成淺水槽,上覆覆膠布,貯水於水槽內,以提高空氣溫度,但是需要注意通風。(三) 、病蟲害   病蟲害有鐮刀菌、疫病菌之猝倒病,細菌軟腐病等。害蟲有蛞蝓、蝸牛、紅蜘蛛類等。
(四) 、採收   平地因夏季高溫,多雨,70%以上植株易猝倒死亡,因此平地宜春秋、冬天種植,但無法越夏。以海拔600-1000公尺之地區為例,平均株重10個月約2公克,18個月3.7公克。以一年至一年半之栽培期,每公頃產量2000-3700公斤。上述栽培技術介紹中,最大的關鍵點在於設施結構與環控設備。以具有屋頂,四週有網、屋頂上下有遮蔭網的栽培設施,其主要的環控作業只有內遮蔭網的收啟。而通風作業只有憑藉外界的自然風力。但是由於四周防蟲網與遮蔭黑網的阻擋,自然風力的通風量大減,少數設施雖然加裝了機械通風扇,但是由於通氣量不足,牆壁為防蟲網的網目非氣密物質,因此風壓生了短路無法有效進行內外換氣。對大多數的設施而言,除非位處山風盛強大的地點,否則在炎夏,設施內部都處於高溫高濕狀態,各種病害叢生。而在海拔1000公尺以上的山區,幾乎有半年仍無法逃避此種內部熱累積效應。在冬季,由於以網室牆壁為主,無法以溫室效應進行內部加溫,山區之氣溫更低,因此更不利金線蓮成長。在春天多雨季節,設施內部高濕加上通風不良更容易得病。因此在遮蔭網室內真正適合種植金線蓮的季節只有秋天。此外,設施內部以淺溝,淺槽聚水以增加相對濕度。在自然蒸發狀態下,加濕效果有限。相反地導因空氣中的灰塵逐漸沈積水槽內,因而青苔叢生,形成病菌繁殖溫床,使內部病害更加嚴重。有些農民以逐次施用高濃度藥劑進行防治,不見得有防治效果,反而增加消費者疑慮。由於國內的主要栽培時期在秋天開始,此時設施內部微氣候為最適合的環境,為秋高氣爽之季節。因此剛種下後成活率很高,給予農民信心。但是冬天來臨之後低溫導至成長緩慢。春天的雨季,因高濕帶來大量病害。4-5月以後的陽光,開始產生在設施內部嚴重的熱累積,也正是病蟲害的高峰期,因此通過此整年考驗下仍然倖存植株不多,其鮮重也不足。此外侵襲金線蓮的病蟲害有太多種類,推廣刊物內列出的種類僅為其中一部份。但是由於高價位,給生產者一個期盼,一個希望。希望在於“只要能夠種得活,種得久,一定能夠賺到錢”。在金線蓮的栽培環境中,主要的爭議一點在於溫度環境。所有的推廣刊物均強調在20-25℃之溫度範圍內。以國內的大氣環境而言,僅有冬天才有此環境,而夏天以水牆降溫也只能維持溫室內部溫度於28℃。因此若以溫度為標準,國內不論平地或高山都並沒有種植金線蓮的條件,然而市場上卻見到鮮株之供應量,因此“20-25℃之生長條件”,仍有爭議存在。在經過詳細的栽培試驗後,金線蓮之適合溫度應為20-30℃,而非20-25℃。理想的金線蓮設施必須含以下的條件一、氣體環境(日照量、溫度、相對濕度等)可以適合作物;二、根部的環境(介質水份、通氣性、肥份等)適合作物;三、整體境維持在無菌,無法或是菌害,蟲害控制在一定密度之下。在國內民間的實際栽培試驗研究中,已有成功之實例。在南投縣與屏東縣的平地地區兩處試驗中,所用的溫室為以塑膠布為覆蓋物的半固定結構,不包環控設備之造價每坪低於4500元。配合遮蔭網、機械通扇、和噴霧設備,使設施內部夏天維持25-30℃之溫度。冬天維持20-25℃之溫度。噴霧設備除了夏天降溫,也可以做為加濕設備。理想濕度為75%至95%。內部光量藉由遮蔭網開閉加以調整。塑膠布溫室再搭配適切的防蟲網,以隔絕蟲類進入。進入溫室之介質,灌溉水,種苗均經過消毒或殺菌處理。依介質之水份狀態加以灌溉,並適當施用花寶肥料。在嚴謹的管理作業下,自當年九月開始種植金線蓮。到了第二年的四~五月,植株已到達可銷售階段。經過9-10月之栽培,每株鮮重平均6-8公克,較大者可高達12公克,而每一栽培盤種植88棵,每盤約有1台斤,溫室內植床上每坪可放置22個栽培盤。在一百坪溫室內,以85%的栽培空間利用率,每期產量可高達1800台斤以上。推廣手冊在農政單位之資料,傳統栽培產期18個月,每株3.7克。由此可見不同的栽培技術即有顯著不同之結果。 由民間成功的栽培個案可知,農政單位推廣手冊中所敘述之資訊(如溫度20-25℃),因時間、空間之不同,並不是絕對的栽培限制條件。在設施利用方面,揚棄“以最低成本為選用標準而採用遮雨網室”,近而利用價格合理的半固定塑膠布溫室結構與環控設備,使內部微氣候到佳調節,配合嚴謹的管理可杜絕病蟲害的侵入,如此可以使傳說中難以栽培的作物,成為工廠式的生產。由生產面積,生產季節之規劃,即可控制產量與產期。這種傳奇般作物,只要用心的研究以設施環控結合栽培技術。生產金線蓮則不再是神話,也不成問題,而真正尚待解決的問題反而在於此產品的利用與銷售。
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  • 5月 29 週三 201309:22
  • 臺灣紅豆杉──林業試驗所育林組 何政坤



臺灣紅豆杉──抗癌藥物紫杉醇的另一個家



何政坤 行政院農業委員會林業試驗所育林組



http://web1.nsc.gov.tw/ct.aspx?xItem=7878&ctNode=40














灣紅豆杉(學名:Taxus
sumatrana
(Miq.) de Laub.,紅豆杉科)或稱南洋紅豆杉,屬於裸子植物,是臺灣貴重針葉五木之一。臺灣針葉五木包括檜木類、臺灣杉、香杉、臺灣肖楠與本文所述的臺灣紅豆杉,它們都是臺灣最珍貴的樹種,木材品質優異,被分類為針一級木,多屬於高大的喬木。紅豆杉稀疏地分布在臺灣全島海拔二千公尺上下的山區,在相當於人的胸部高度處,量取的直徑都在一公尺以上,樹高達二十公尺以上,樹幹略扭曲,比起其他四種針葉木,它是樹形較矮胖、樹姿較醜的樹種。
可是別看它醜,它包被紅色假種皮的果實,狀如紅豆,是所有針葉五木中果實最鮮豔漂亮的。它的木材也比其他四種顏色豐富,樹心的部分是紅色,邊緣的部分是黃色,是很好的雕刻用材。木材雕刻家曾將臺灣紅豆杉木材雕刻成一人高的觀音,售價高達一千萬元。
民國七十年代,臺灣紅豆杉因懷璧其罪,不斷地慘遭盜伐;政府查禁後,初期對沒入的盜伐木,採取公開標售的方式處理,在民國七十八年時,一棵盜伐木標售到一百八十萬元,創下臺灣盜伐木標售的最高紀錄。為了杜絕這些破壞臺灣天然林木的山老鼠,先盜伐再藉政府標售方式合法取得,在民國七十九年時立法院特地立法禁止臺灣紅豆杉盜伐木標售,終於澈底斷絕臺灣紅豆杉遭盜伐利用的厄運。
抗癌藥物紫杉醇 約在民國五十五年時,美國的「國家癌症研究中心」從太平洋紫杉(學名: Taxus
brevifolia
Nutt.)的樹皮中萃取出紫杉醇(Paclitaxel 商品名 Taxol),發現它具有抗癌的效果,經過一連串的臨床試驗,民國七十八年正式製成製劑用來治療卵巢癌與乳癌。由於它的治療效果甚佳,使得太平洋紫杉被預言為「二十世紀對人類貢獻最大的植物」。
不過太平洋紫杉生長緩慢,從樹皮萃取紫杉醇的產量又甚低,以治療一個卵巢癌病患需要二公克紫杉醇而言,就需要砍伐二到三棵 50
~ 60
年生的太平洋紫杉,如要萃取一公斤的紫杉醇,就需要砍伐二千至四千株的太平洋紫杉。所以當時一公克的紫杉醇售價高達八百美元,於是全世界研發人員開始投入如何量產紫杉醇的研究工作。
對林木育種家而言,最直接的方式就是選育高紫杉醇含量的品種,而且最好是枝葉含有高濃度紫杉醇的品種,畢竟枝葉是可以不斷再生、不斷採收的。如果紫杉醇的取得是來自於樹皮,因為樹木一經剝皮就會死亡,其生產成本勢必過高,而且收成時間也過久。
對化學家而言,則是利用合成的方式,由簡單且容易取得的化學單元體合成紫杉醇,民國八十三年實驗成功了,總共經過 28 個步驟,化學家可在試管內完全合成紫杉醇,當時可是一件大事!雖然最後合成的紫杉醇產率僅有 0.5%,不過化學家並不氣餒,他們知道如果將合成的步驟縮短,就有商業化生產的價值。 經過多方尋覓,最後發現紅豆杉的萃取物中含有濃度甚高的紫杉醇主結構 10-去乙醯巴卡亭III(簡稱
10-DAB
),這種成分在少數紅豆杉品種的枝葉中濃度高達 1,000 ppm(ppm,每公斤乾重的毫克數),是紫杉醇的三倍以上。利用 10-DAB 作為合成的起始物,只要約 10 個步驟就可合成紫杉醇,在實驗室中的合成率可達 80% 以上,這種方法稱為半化學合成法,以別於全合成法。
對生物學家而言,是積極尋找可以生產紫杉醇的微生物,他們發現寄生在太平洋紫杉上的一種真菌可以生產紫杉醇,由於真菌生長快,用來生產紫杉醇相當看好。對組織培養學家而言,就是想辦法在發酵槽內培養紅豆杉細胞,利用細胞來生產紫杉醇;組織培養學家本來就很有興趣利用細胞培養生產人類需要的藥物,但是成果並不理想,主要的原因是這些藥品的價格還沒有高到使廠商有投入量產的意願。如今終於有一種這麼昂貴的藥物,而且需求量又不斷增加。
根據最近的統計,紫杉醇在全球的市場需求量高達十八億美元,占所有抗癌藥物市場的 25%!因此帶動了全世界細胞培養的研究熱潮,目前最大的發現就是找出了一種叫做甲基茉莉酸(methyl jasmonate)的誘導物質,它可使紅豆杉細胞生產紫杉醇的產量暴增
10
倍以上。 另外,目前最熱門的生物技術學家又如何看待紫杉醇的生產呢?他們則是從找尋合成紫杉醇的基因著手,近三年內他們差不多已經將這些基因選殖出來了,接著便是如何將基因轉殖到紅豆杉細胞中,甚至是微生物,讓它們為我們生產廉價的紫杉醇。
紫杉醇的原料來源 前面談了許多紫杉醇的生產方法,經過 10 年的開發,紫杉醇原料價格從剛開始的每公克八百美元,滑落到目前的三百美元,價格雖降低頗大,但是仍相當昂貴。大家一定很好奇,究竟哪種生產方法是原料的主要來源?答案有點出乎意料,目前是以半化學合成法為主,而原料就是 10-DAB,提供 10-DAB 來源的植物,主要是歐洲紅豆杉的枝葉!
採取半化學合成法的主要原因,除了 10-DAB 在枝葉中的含量是紫杉醇的三倍以上外,另一個重要因素是天然的紫杉醇再怎麼純化,總會含有微量的雜質,這些微量雜質會隨栽培方法、環境變化而異,造成品管上的困難。同樣是純度 99% 的天然紫杉醇,永遠難以保證不同批原料的雜質是一致的,這些雜質均須通過檢驗,證明它們對人體無害,才能進一步製成藥劑。
反之,半合成紫杉醇經過合成步驟,它的純度高且每批產品品質幾乎一致,合乎藥檢的標準,儘管比天然紫杉醇生產麻煩,但是生產成本不一定比天然紫杉醇高。目前 10-DAB 原料是每公克 90 美元以下,假如每二公克可合成一公克紫杉醇,那就是投入 180 美元可以生產三百美元的藥物,仍有 120 美元的價差,扣除生產成本後仍有極大的利潤。不過這種半化學合成法的技術已經成為專利了,用此一技術生產紫杉醇,要付出高額的專利費。目前,國內的製藥界另行開發了獨特的半合成技術,也可以利用 10-DAB 生產紫杉醇了。 當全世界紛紛投入紅豆杉屬相關樹種的開發研究時,臺灣紅豆杉究竟是否有潛力發展出跟國外具有競爭力的品種或生產模式?然而,當我們開始注意到本土的紅豆杉是否有開發價值時,已經是民國八十三年的事了,比國外的研究足足晚了將近五年。因此當國內學者提出臺灣紅豆杉的優良化學品系選育計畫時,就有人質疑是否可以跟國外具有十分完備的研究機構競爭?如果真有優良的化學品種,以臺灣如此高的土地與人力成本,還會有生產空間嗎?
當學者們想進一步研發,利用臺灣紅豆杉細胞培養生產紫杉醇時,就有人質疑紅豆杉細胞的培養技術國外已經取得專利了,臺灣有能力跟國外競爭嗎?研發出來的技術可能也在國外專利的範圍內,還會有經濟價值嗎?常常我們也會自我反問這些問題,最後總覺得為了了解臺灣本土的資源,建立並保存可能產品化的機制,應該責無旁貸地進行相關研究。
前面提過臺灣紅豆杉的木材價值已經很高了,大家或許認為栽植臺灣紅豆杉經濟價值鐵定極大,可是針對 15 公分直徑小樹的年輪加以計算,竟然高達兩百多歲,對於胸徑一公尺的大樹需要多少年才能長成,就可想而知了。
為了避免這些大樹的基因流失,林業試驗所在民國八十三年,開始進行臺灣紅豆杉的調查與枝葉含紫杉醇濃度的分析;在進行調查分析的同時,也加以採種,利用種子發芽育苗,此外也採集枝條,利用扦插發根成苗,以保存該母樹的基因;更進一步從優良母樹的枝葉進行組織培養,誘導未分化的細胞團(稱為癒合組織)產生,探討以細胞培養生產紫杉醇的可行性;最後透過生物技術,將外來基因成功轉殖到臺灣紅豆杉細胞內。
不可否認的,國內對臺灣紅豆杉的研發工作仍是跟著國外的腳步,但是,這並不意味著我們的產品就會輸給國外。以下就讓我們來看看臺灣利用紅豆杉生產紫杉醇的研究與產業發展潛力。
利用臺灣紅豆杉生產紫杉醇 要在國內以大面積栽培臺灣紅豆杉,再利用機械化採割枝葉以萃取
10-DAB
原料,其栽培方式就像經營茶園一樣,被選育出來的臺灣紅豆杉化學品系必須具備下述條件:臺灣現有產業界具備將 10-DAB 合成紫杉醇的專利技術;10-DAB 在樹梢枝葉中的含量必須高過國外品種;枝葉產量高且耐修剪;由於臺灣低海拔面積較多,所以該品系必須具備耐熱性,可以在低海拔栽培。
為了選育具有這些條件的品系,於是從全臺灣採集天然母樹的枝葉,分析 10-DAB 的含量,將含量較高的品系篩選出來,利用扦插繁殖法,培育出跟天然母樹基因完全一樣的營養系分株,稱之為營養系苗,然後將這些營養系苗栽培到臺灣低中海拔,進行生長與 10-DAB 含量的檢測試驗。結果發現有一些優良的化學品系,可以符合上述的條件,在海拔約七百公尺左右,栽植四年後,它們的枝葉產量每株平均約可生產三公斤,曬乾後約有一公斤重,可萃取出一公克左右的 10-DAB,如果一公頃種植一萬株,就可生產出約 10 公斤的 10-DAB。 此一產值吸引了具有合成紫杉醇技術的臺灣製藥公司加入量產的研發計畫,目前正積極利用扦插繁殖的技術,採集這些優良化學營養系的枝條,利用具有定時噴水系統的溫室,直接扦插在含有泥炭土與蛭石的介質中,約三個月就有 80% 插穗發根成苗,再經三個月培養後,就可移到栽培地栽植。此項計畫預計在五年內建立面積一百公頃的生產區,屆時臺灣就可以使用到由臺灣紅豆杉生產的紫杉醇了。
一般植物細胞培養的方法,都是先採集植物的組織或器官,如葉片、莖段等,經過酒精與漂白水消毒後,培養在含有營養成分與植物生長激素的固體培養基中。在植物生長激素的誘導下,讓植物的組織細胞分裂成鬆軟的細胞團,然後將這個細胞團移入含有培養液的三角瓶內,培養液的體積一般是三角瓶體積的五分之一,約為 50 毫升,這樣可以增加液體搖盪的速度及溶氧的能力,然後將三角瓶放在迴轉式震盪器中培養,迴轉的次數一般都在每分鐘一百次左右。
鬆軟細胞團在培養液中不斷地迴旋震盪,1 ~ 50 個細胞左右的小細胞團就會脫離原細胞團,最後逐漸成為均勻的細胞散布在培養液中,此一過程稱為懸浮細胞培養。由於細胞整個浸泡在培養液中,吸收養分的面積比固體培養僅靠接觸表面的吸收來得大,所以細胞的增殖速率也遠比固體培養的大。
當細胞在培養液中已經快速生長且紫杉醇濃度產量也很高時,這時候就將它們移到 2 ~ 5 公升的小型生物反應器中培養。生物反應器的基本構造是一圓柱型玻璃或不銹鋼筒,內含攪拌葉片使細胞能懸浮在培養液中,同時設有通氣管,將空氣打入培養液內,提供細胞呼吸所需的氧氣。因為在相同的單位面積上,一個生物反應器可以培養比三角瓶大上數倍的容積,所以在商業性生產時就必須採用生物反應器。如果細胞在小型的生物反應器中仍然有很高的紫杉醇產量,在商業性量產規模的規畫下,此時生物反應器的容積可高達數十噸。
根據多年的研究,發現利用細胞培養生產紫杉醇,最關鍵的因子就是優良的細胞株!就像前面所述的化學優良品系選育一樣,來自不同母樹的細胞株,在培養液中的表現也會呈現極大的差異。優良的細胞株需要具備生長快、紫杉醇濃度高,而且經過長期培養不會降低生產力等特性。經過將近八年的努力,長期監控數十個細胞株的表現,終於選育出符合上述特性,可以用來生產紫杉醇的優良細胞株,目前如利用三角瓶培養,該細胞株可以每天每公升生產五毫克以上的紫杉醇。
根據報導,國外用來培養紅豆杉細胞的生物反應器的容積已高達 75 公噸,如果將該細胞株放入 75 公噸的生物反應器中生產,每天將可生產 75 公克的紫杉醇,也就是一年可生產約 27 公斤的紫杉醇!不過目前尚未看到產品。林試所的研究團隊證實將本土選的優良細胞株培養在二公升的生物反應器中,發現仍能維持很高的紫杉醇產量,此一結果已引起業界的投資興趣,規劃用更大的生物反應器來生產紫杉醇。
遺傳工程與生物技術被認為是影響二十一世紀人類生活最重要的科技。此一技術是否能用來增加培養細胞的紫杉醇產量呢?答案是肯定的!一個成功的遺傳工程除了要有影響紫杉醇合成的基因外,還要有將基因轉殖到紅豆杉細胞的技術。目前已知控制紫杉醇合成的基因大約有 10 個以上,其中最重要的基因是將 10-DAB 催化為巴卡亭(BC)的去乙醯巴卡亭轉移酶(DBAT)基因。 由於控制紫杉醇的基因數目太多了,在遺傳工程上要將這麼多的基因全部轉殖到紅豆杉細胞上,技術甚為困難,通常會選擇最關鍵的基因轉殖,來達到目標產物生成的目的。10-DAB 與巴卡亭都是極佳的產物,因為它們均可經半合成而成為紫杉醇,而且分子大約是紫杉醇的三分之二,細胞較容易將它們釋放到培養液中,所以從培養液中可以不斷地得到此二項產物。
如果將可令 DBAT 大量合成的順義 DBAT 基因或可抑制 DBAT 合成的反義 DBAT 基因轉殖到紅豆杉細胞內,前者會增加 DBAT 基因的表現,使 10-DAB 快速合成巴卡亭;而後者剛好相反,將 DBAT 基因的表現抑制,所以細胞僅能合成到 10-DAB,如此一來細胞就僅能生產 10-DAB 產物。目前研究人員已經成功選殖出 DBAT 基因,並且嘗試將它轉殖到臺灣紅豆杉的細胞內,預期它能夠對細胞生產 10-DAB 產生影響,又因為它的分子量小於紫杉醇,可以不斷地分泌到培養液中,這樣就可以建立連續收穫 10-DAB 的生產模式。 前基因轉殖的方法雖然很多,但以農桿菌為媒介的轉殖法最為常用。農桿菌原是一種土壤的病原菌,當植物受傷時,細胞會分泌一種酚類物質,誘使農桿菌內的小環形染色體(稱之為質體)中的一段去氧核醣核酸(DNA)切離菌體,移轉到植物細胞內,並嵌入細胞內的染色體中,讓植物細胞產生該段
DNA
上的各種功能。 段 DNA 具有生產促進細胞產生腫瘤或不定根的植物生長激素基因,以及供農桿菌生長的特殊營養成分。當植物細胞帶有該段 DNA 後,就會形成腫瘤,或者形成毛狀根群。如果利用野生的菌種去感染臺灣紅豆杉,就會產生可自行生長的細胞腫瘤或毛狀根群,與正常細胞需要植物生長激素才能生存完全不同。由於此一段 DNA 插入到植物細胞染色體上的位置不同,插入的數目也不一樣,因此轉殖基因細胞與毛狀根群在生產紫杉醇的表現,也會產生很大的差異。
目前它們的生產量尚低於正常的細胞培養,不過生長速率卻相當快,培養容易且帶有獨特的基因標誌,不會侵犯到目前許多的細胞培養專利技術是其重要的特性。林試所從許多野生的菌種中篩選能夠很快感染臺灣紅豆杉的菌株,它們的感染率可高達 30% 以上,選擇此一菌種,利用遺傳工程的技術,將致病的基因切除改植入 DBAT 基因,然後再去感染台灣紅豆杉的細胞,這樣就可獲得轉殖 DBAT 基因的紅豆杉細胞了! 利用臺灣紅豆杉生產紫杉醇,在可見的未來,將會為臺灣創造數十億元的商機。利用大面積栽培台灣紅豆杉是比較傳統的生產方式,投資額大,但植物產量容易控制,風險低。利用細胞培養或根部培養,是一種可以用自動化工廠經營的生產模式,然而每一個製程都必須小心,防止生物反應器可能遭受到細菌與霉菌的污染,同時還要防止細胞在培養過程中難以避免的變異(突變),也就是說每批產品可能會有相當程度的差異,不過由於目前細胞的產量頗高,細胞輕微的變異仍可以忍受。為了防止細胞變異的發生,需要開發出低溫保存細胞的方法,一旦利用生物反應器培養的細胞劣化,立刻可以用低溫保存的細胞加以替換。
轉殖有植物生長激素基因的細胞,因培養在不含植物生長激素的培養液中,產生細胞變異的機率比較小,又帶有基因標誌,可以避開國外在培養基與細胞株上的專利,是頗有發展潛力的技術,但仍須進行更多的研究,以提高紫杉醇的產量。至於轉殖 DBAT 基因以促進紅豆杉細胞生產 10-DAB 或 BC,則是未來看好的細胞培養方式。 雖然國外科學家從太平洋紫杉與歐洲紅豆杉選殖出來的 DBAT 基因已經獲得專利,而從臺灣紅豆杉選殖出來的 DBAT 基因與該二樹種胺基酸序列的相似度高達 95% 以上,如果國內使用該基因必須付專利費;但紅豆杉的基因轉殖系統,其技術發展在臺灣已頗為成熟,相信一定可以比國外更早一步得到轉殖 DBAT 基因的細胞,尤其是反義 DBAT 基因(並未被取得專利),以大量生產 10-DAB 供臺灣業界直接使用。 最後,在臺灣紅豆杉的研究過程中,讓我們深深地體會到研發技術固然重要,但擁有豐富的植物資源更為重要!如果我們研究的是外來品種,要選出優良的化學品系本身就很困難,要適應臺灣的環境更是需要漫長的時間檢驗。臺灣紅豆杉的研發腳步雖然慢,但是整個研發體系是建立在最基礎的傳統育種收集,到各種珍貴品系的選拔,才能建立自有的化學品系、細胞培養與遺傳工程技術,加上國內的製藥界也不斷地追求技術的創新,讓國內的研究團隊,能夠有機會利用本土的臺灣紅豆杉,為臺灣創造大規模生產紫杉醇的產業。


 



 




 




 




 




 




 




 






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  • 5月 29 週三 201308:17
  • TLC檢測-!!



紫杉醇生產工藝如下:1 紅豆杉樹皮粉碎(越細越好),85%~95%酒精(料液比是多少?)35-55℃熱回流浸提三次(每一次需要多少時間?).2 50-70℃真空減壓濃縮至熱測比重1.1~1.2g/ml.3 氯仿萃取,萃取液濃縮成膏狀,得紫杉醇含量1%氯仿膏.4 將紫杉醇含量1%氯仿膏加氯仿溶解完全.5 加矽膠攪拌均勻,涼乾,過篩.6 填裝到層析柱中,氯仿-甲醇梯度洗脫,TLC檢測,分段合併濃縮,得紫杉醇含量5~8%半成品.7 將紫杉醇含量5~8%半成品加丙酮溶解完全,加矽膠攪拌均勻,涼乾,過篩.8填裝到層析柱中,丙酮-石油醚梯度洗脫,TLC檢測,分段合併濃縮,得紫杉醇含量20 ~25%半成品.用丙酮-石油醚系統結晶3~4次,抽濾.9 50℃真空減壓乾燥,得紫杉醇含量75~80%半成品.10 16Mpa壓力層析分離,TLC檢測,分段合併濃縮.11 目標段濃縮物丙酮-石油醚結晶,抽濾,乾燥,得紫杉醇含量≥99.5%成品.12 去除膠質的過程為:高壓矽膠層析柱層析去除膠質,同時將紫杉烷化合物分離為紫杉醇、三尖杉寧鹼、紫杉醇3部分。
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  • 5月 28 週二 201320:47
  • 高效分離純化紫杉醇的方法!!!



http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_CN_CB3273425.htm 
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  • 5月 20 週一 201318:59
  • 高效液相層析儀之基本組件!!!



 高效液相層析儀的構成組件 *A:溶劑(耗材) *B:2溶劑切換開關閥 *C:水泵 *D:壓力阻尼器 *E:Mischkammer *F:手動進樣器 *G:層析管柱(耗材) *H:高效液相色譜法控制器 *I:檢測器(紫外吸收光譜儀等) *J:檢測數據A/D轉換器(數據輸出系統) *K:電腦(用作數據記錄器數據分析系統) *L:印表機
儀器分析林志城、薛文發編著

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  • 5月 14 週二 201310:17
  • 紅豆杉細胞生產紫杉醇的平台!!!


 
http://agbio.coa.gov.tw/image_doc/09%E5%8F%B0%E7%81%A3%E7%B4%85%E8%B1%86%E6%9D%89%E6%A0%BD%E5%9F%B9%E7%94%A2%E6%A5%AD%E4%B9%8B%E5%89%8D%E6%99%AF%E8%88%87%E7%AB%B6%E7%88%AD%E5%8A%9B-%E5%B0%88%E8%A8%AA%20%E6%9E%97%E6%A5%AD%E8%A9%A6%E9%A9%97%E6%89%80%20%E4%BD%95%E6%94%BF%E5%9D%A4%E7%B5%84%E9%95%B7.pdf
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  • 5月 14 週二 201310:10
  • 全球紫杉醇藥品市場規模!!!!



1963 年美國國家癌症研究所(National
CancerInstitute, NCI)
首度證實來自太平洋紫杉(T.brevifolia ) 樹皮萃取物可在體外模式下抑制癌細胞生長。1966 年Monroe
Wall
博士從中分離出主要活性成份紫杉醇(Paclitaxel),商品名為Taxol,其相關分子結構則於1971 年被發表,科學家更在1977年發現紫杉醇可抑制人類腫瘤細胞有絲分裂的過程達到制止腫瘤生長的效果,而在往後的10 年中NCI 從30 噸的樹皮中萃取出2 公斤的紫杉醇進行各項臨床試驗。1988 年紫杉醇被用於化療失敗的卵巢癌患者,發現有30% 改善效果;1990 年在轉移性乳癌試驗中, 48% 的結果有腫瘤縮小現象,此時,紫杉醇開始被認為具有對抗癌症的潛力化合物。根據BCC
Research (2006)
產業報告顯示,2006 年全球紫杉醇藥品市場規模約有12 億美元,估計至2011 年約達18 億美元,平均年成長率約8.4%。我國林業試驗所自1993 年開始投入台灣紅豆杉調查與枝葉含紫杉醇濃度的分析研究,其中以現任育林組
何政坤組長投入最深,堪稱相關研究領域的關鍵人物,從早期的品種選育,至後期產學合作,一路走來究竟遭遇如何的困難?他又是以何種策略突破困境?其執行經驗,值得農業生技產業所有成員學習參考。「太平洋紫杉生長緩慢,從樹皮萃取紫杉醇的產量又低,如果以治療一位卵巢癌病患需要2 公克紫杉醇而言,需要砍伐二到三棵50-60 年生的太平洋紫杉,除了造成林木的減損外,當時Taxol 藥品價格也因量少而昂貴。於是全世界研發人員紛紛投入如何量產紫杉醇的研究工作」何組長說。何組長進一步解釋,以林木育種觀點,首要目標乃選育出高紫杉醇含量的品種當作生產平台,且以枝葉含高濃度紫杉醇的品種為佳,如此只要採收枝葉進行加工,而後枝葉又可再生。如果紫杉醇的取得是來自於樹皮,樹木一經剝皮就會死亡,其生產成本勢必過高,而且收成時間也較久。1990 年美國Bristol-Myers
Squibb
公司發現歐洲紫杉(T.
baccata)
的葉子及小樹枝中含有高濃度的紫杉醇主結構10-DAB(10-deacetylbaccatin III),利用10-DAB
作為合成的起始物,只要約 10 個步驟就可合成紫杉醇,在實驗室中的合成率高達80%,此法屬於半化學合成(semisynthesis),成為供應現今臨床上紫杉醇藥物原料的主要方法。比起從太平洋紫杉樹皮萃取,造成樹木大量死亡,可大幅降低對生態系統的不良影響。「運用這個生產方式以產業化觀點是更有效率的!天然的紫杉醇再怎麼純化,仍有可能含微量雜質,且雜質會隨著栽培方法、環境變化而異,造成品管上的困難。反之,半合成紫杉醇經過合成步驟,純度高且每批產品品質幾乎一致,合乎藥物生產及檢驗標準,儘管比天然紫杉醇生產複雜,但是生產成本不一定比天然紫杉醇高。」何組長補充道。目前運用該法生產紫杉醇的主要企業為美商Bristol-Myers
Squibb
和Mayne
Pharma
公司。台灣紅豆杉(Taxus
sumatrana (Miq.) de Laub.)
或稱南洋紅豆杉,屬於裸子植物,是臺灣貴重針葉五木之一。分布在臺灣全島海拔二千公尺上下的山區,木材顏色較其他四種針葉顏色豐富,為很好的雕刻木材。1980 年代因具有經濟及藥用價值,使其飽受盜伐之害。為了避免樹木的基因流失,林業試驗所的研究團隊於1994 年,開始著手台灣紅豆杉的研究調查,分別採集種子與枝條,發芽育苗或扦插發根成苗,以保存母樹的基因。此外,也開始研究評估台灣紅豆杉生產紫杉醇的潛力。何組長回憶,當時國外的研究已領先五年之久,許多關鍵技術的專利可能掌握在國際大廠,加上台灣的土地資源有限、人力成本高昂等不利條件,是否還能建立產業競爭優勢?最後,考量為妥善保存及有效運用本土資源,建立產業化機制,遂義無反顧的投入紅豆杉栽培產業的研究。「當初考量若在國內大面積栽培紅豆杉,並建立具有經濟效益的生產方式,必須符合幾個要點:枝葉中的紫杉醇或10-DAB
濃度高,便於採收;具耐熱性可在低海拔快速生長,有利大面積栽培。再加上建立機械化的採收枝葉模式,就可形成像茶園的經營模式。」何組長指出。為了篩選出符合上述條件的品系,何組長從全台灣各地採集天然紅豆杉枝葉,分析其中紫杉醇與10-DAB
含量,篩選出濃度高的優秀品系。之後利用微體繁殖及扦插繁殖法,培育出與母樹基因相同的營養系苗,再將營養系苗栽培到低中海拔地區,測試生長狀況與紫杉醇含量分析。為此,何組長也在實驗室建立一系列紫杉醇萃取、純化和濃度測定的方法,以配合在不同生長條件的研究設計下,掌握紫杉醇與10-DAB
濃度變化情形。「經過八年的選種作業,我們已選育出台灣紅豆杉T1 品種,可在低海拔生長快速、耐熱,且枝葉紫杉醇含量高。該品種與栽培生產技術現已專屬授權給國內廠商,也朝向申請植物品種權方向進行。但台灣紅豆杉現還不屬於植物品種權適用申請作物的範圍,關於智慧財產保護這部分有待突破。」何組長說明,「從2001 年起,陸續就有國內業者對我們選育的紅豆杉有興趣,表達合作意願。但當研發計畫開始走出實驗室,落實產業化的時候,許多產業界問題也逐漸浮出,大大挑戰研究人員解決問題的能力。」「“成本"是廠商考量產業化的重要因素,包括:土地種植成本、枝葉採收、及後處理成本等。對廠商而言,如果在本地生產無法達到低單位成本的生產模式,產品在國際上的競爭力勢必下降,也降低廠商在台灣設立生產中心的意願。目前國際生產紫杉醇的植物原物料成本約每公斤2.5 美元。」何組長指出,「由於林試所擁有的土地較為貧瘠,所以當時除尋覓適合栽種的土地外,土地租金為一大考量因子,早期有業者考慮承租台糖土地與林試所進行產學合作,但當時每公頃租金要新台幣20 萬元,最後因無完整的規劃案,而宣告失敗。現階段台灣紅豆杉栽培區是與原住民合作社合作,建立在台東地區原住民的可農耕保留地上,租金每公頃約新台幣2 萬元,雖然運輸成本較高,但整體栽種成本相對之下是可被接受的。」此外,根據廠商產業經驗與林試所研究團隊執行結果發現,枝葉採收與後處理成本在整體生產平台中,可能超過農場經營的種植成本。「枝葉採收階段與後處理係指利用採收機採收枝葉、運輸、乾燥、粉碎、包裝等。以目前的設備僅能處理小規模約3 公噸的枝葉,未達到可以處理大量枝葉的穩定生產流程,在產能放大與處理效率提昇的問題仍有代解決。」何組長認為,結合農機公司合作開發出自動化枝葉採收與處理設備,才可有效降低生產平台的成本。藉由專屬授權取得台灣豆杉T1 品種的業者,已計畫在今(2008)
與明(2009)
年分別栽種10 公頃的紅豆杉,並委託林試所培育16 萬株苗木,預計三年後每公頃可生產6 噸的乾枝葉,萃取出約1.8 公斤紫杉醇。林試所團隊提出一研發產業聯盟,建立台灣紅豆杉量產紫杉醇的生產線,聯盟成員及任務為1. 林試所:選育優良品種,建立栽培採收技術。2. 原住民:提供土地及農作經驗。3 造林業者:種苗繁殖與農場4. 農機業者:開發自動化枝葉採收、粉碎乾燥設施。5. 藥廠:紅豆杉枝葉萃取紫杉醇及純化技術。首先,協助造林業與原住民成立原住民合作社,建立台灣紅豆杉農場經營、枝葉採收、運輸、粉碎、乾燥等作業流程;協同農機業者開發自動化採收設備,以支應未來每公頃20 噸枝葉的產量。對於後端萃取純化作業,則與藥廠建立品管分析標準,用以確認苗木繁殖與栽種過程中品質變化。未來,對於大面積農場化栽培的台灣紅豆杉,建立標準作業流程及風險管理,如遭遇蟲害、天災等危機處理原則。而大量枝葉採收後處理的乾燥粉碎生產平台由於處理效率未能提升,加上投資設備金額亦高,亦成為聯盟成員亟待克服的問題。除了從紅豆杉萃取紫杉醇,美國Bristol-MyersSquibb 公司在2002 年便建立植物細胞培養方式,並直接萃取其中紫杉醇。和半化學合成比較,細胞培養的產物不需再經過化學轉換,可免除中間化學產物的生成,也不需使用到樹葉或樹枝,減少固體廢棄物生成,大幅減少化學品使用與廢棄物處理的成本。近年來,各國科學家則朝向利用基因轉殖植物細胞生產紫杉醇平台的目標建立。「現在全球紫杉醇原料來源仍是以枝葉萃取為主。但植物細胞生產平台有其研發的必要性,除了利用基因改造技術大幅提升生產效率外,與枝葉生產平台因環境或氣候變化因素所造成的收穫量降低之情況比較,細胞培養的產量相對是穩定的。」何組長說明,「利用植物細胞培養生產紫杉醇,優良的細胞株仍為關鍵因素,來自不同母樹的細胞株,對培養基的生長條件及產生紫杉醇或10-DAB 的濃度也大不相同。所以篩選具生長快速、可穩定生產紫杉醇的紅豆杉細胞也耗費我們相當長一段時間。接續則是將紫杉醇生合成相關基因,如taxadiene synthase (TS)10-deacetylbaccatinIII-10-O-acetyl-transferase(DBAT)
轉殖入紅豆杉細胞,希望可大幅提升產量。」何組長是利用農桿菌為媒介,將植物生長激素基因轉殖到台灣紅豆杉細胞,誘導出轉基因細胞與轉基因毛狀根群,可大量生產紫杉醇前驅物。此外,收集細胞培養液,從中萃取10-DAB 等紫杉醇前驅物,其純化過程較從天然枝葉中容易,原因是培養液成分較簡單,雜質較少。隨著對紫杉醇生合成基因的逐漸瞭解及基因重組、轉殖、表現平台等生物技術的進展,可預期的是,未來紫杉醇原料來源將逐漸轉向植物細胞生產模式。「目前以紅豆杉細胞生產紫杉醇的平台,也是在產業化上遭遇到困難!主要關鍵在於製程放大的量產階段。」何組長指出,「曾有廠商依據我們的毛狀根群與細胞培養的特性,開發出5 公升國產生物反應器,細胞在其中的生長效率良好,且紫杉醇類產出濃度亦符合在實驗室生產的標準。然當繼續朝大型20 公升的反應器開發時,細胞生長相關條件的研發在此遭遇瓶頸,而終止投資研發計畫。」「建立生物反應器的投資額很高,一個20 公升的反應器及相關設施,需新台幣320 萬元,若是建立一組5000 公升的反應器則大約需要4 億元設備投資。但若無法在量產放大階段證實植物細胞生產紫杉醇平台是具有商業潛力,則更難吸引產業界投入。目前我們是傾向波浪式反應器來建立紅豆杉細胞量產線,主要是利用可拋棄的培養袋培養紅豆杉轉基因毛狀根群,利用該培養袋生產亦可符合cGMP 的生產規範,然而以一個1公升的培養袋就約1萬元,相關機器則約26 萬元,以目前研發角度來看成本仍算高。」「跟產業接觸後,才真正知道產業的需求在那。」「對研究人員而言,產業概況與市場資訊的蒐集是很困難的,但卻是廠商關心的問題之一,究竟現在投入研發可行性高嗎?」何組長清楚點出學研界與產業界的藩籬。而他從實驗室的" troubleshooting",到產業化的"problem-solving",累積超過十年的經驗也就更顯得珍貴。請教他接下來的研究規劃是什麼?「台灣紅豆杉量產紫杉醇的生產平台,仍還有許多瓶頸有待克服。雖然台灣紅豆杉的研發速度較國外是落後的,但整個研發體系與生產平台是建立在本土,包括植物育種、研發團隊及產業聯盟等,這對建立台灣的紅豆杉栽培產業是很重要的。」「藉由台灣紅豆杉量產紫杉醇計畫,我們已在研究室成功建立"植物品種選育與繁殖"和"植物細胞培養"雙平台,未來針對有價值苗木開發計畫都採取雙軌進行,最終再選出成本較低、具商業潛力的生產平台,進行產業化推動。目前正在執行植物品種培育計畫包括青脆枝、牛樟、桉樹、麻瘋樹都是具有經濟價值的樹木。」農業的角色之一在於提供各產業所需之原物料,台灣農業在知識經濟趨勢下,應用生物技術育種出最具成本效益的優良品系,並開發出穩定的的高品質生產平台,可提升台灣跨產業之整體競爭力。何組長樂觀表示,台灣具有深厚的農業科技基礎,加上生物技術的突破,以及產學合作的經驗累積,台灣農業生技產業化勢必更加快速且成熟。
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  • 5月 13 週一 201320:41
  • 分離純化紫杉醇的方法(3)....!!!!TTC



酒精氯仿萃取氯仿溶解氯仿-甲醇梯度洗脫丙酮溶解氯仿-甲醇梯度洗丙酮溶解丙酮-石油醚梯度洗3~4次抽濾50℃真空減壓乾燥16Mpa壓力層析分離丙酮-石油醚結晶紫杉醇含量≥99.5%成品高壓矽膠層析柱層析去除膠質紫杉烷化合物分離為紫杉醇、三尖杉寧鹼...
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  • 5月 13 週一 201320:38
  • 分離純化紫杉醇的方法(2)....!!!!TTC



由紅豆杉屬植物的樹皮或樹葉中提取。紅豆杉樹皮或樹葉陰乾,磨細後,和95%乙醇提取。提取液濃縮至乾,剩餘物用水和二氯甲烷混合攪拌。靜置分出有機層,水層用二氯甲烷提取多次。提取液和有機層合併後,濃縮至乾。剩餘物溶入醋酸乙酯-甲醇(3:1),和新鮮矽藻土拌和後,減壓蒸除溶劑。剩餘的粉末進行快速柱層析,先用己烷洗,後用二氯甲烷洗脫。收集後者,減壓蒸去二氯甲烷。剩餘物溶於醋酸乙酯,用70套(每套3~4根)裝有矽膠的中壓快速色譜柱進行層析,用不同配比的己烷-丙酮洗脫。收集含產物的組分,濃縮。剩餘物再經裝有矽膠的中壓快速色譜柱純化,用不同配比的甲醇-二氯甲烷洗脫。收集含產物的組分,減壓濃縮至於。剩餘物再經製備型高效液相色譜儀分離,得到的產物再用含水甲醇重結晶2次,即得紫杉醇純品。產率:樹皮0.028%,樹葉0.0088%。收率:樹皮93.3%,樹葉88%。熔點212~214℃,[α] D
20 -49°(1%,氯仿)。中國紅豆杉莖皮經粉碎,陰乾後,用1%檸檬酸水溶液浸泡24h後開始滲漉。用二氯甲烷萃取滲漉液,萃取液乾燥後,濃縮,真空抽乾。用矽膠進行2次柱層析,收集的流出液中含有紫杉醇和三尖杉寧鹼。基於它們側鏈結構的不同,把它們溶於四氯化碳中加溴,只對三尖杉寧鹼進行溴化,再經矽膠柱層析,可得只含紫杉醇的流出液,經處理後,得紫杉醇精品,含量99.19%,收率​​4.5×10 -5,回收率70%。
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  • 5月 13 週一 201320:36
  • 分離純化紫杉醇的方法(1)....!!!!TTC



分離純化紫杉醇的方法....!!!!TTC
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