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Real-time PCR 的精確掌握染病植株的病重程度!!!

 

 

蝴蝶蘭是台灣產值極高花卉品種，但蝴蝶蘭嵌紋病卻一直困擾花農。受到

感染後的植株，除了葉子出現嵌紋外，花也會變的畸型而滯銷。目前多用ELISA

檢測病毒，但常發現肉眼看似無病，事實上卻帶有病毒的植株。本試驗以Real-time

PCR 的方式，檢測蝴蝶蘭感染不同程度的CymV，利用Real-time PCR 的精確

性，掌握染病植株的病重程度，即使只有微量的感染，也可以準確無誤的檢測出

來。結果顯示蝴蝶蘭感染不同程度的CymV後，經Real-time PCR的檢測其ct值介

於13.6179~14.1400，不同程度的感染其數值差異不大但均較對照組之23.3318表

現明顯，所以利用real-time PCR的方式可以偵測到蝴蝶蘭感染微量的CymV，但

不同程度的感染無法加以區分。

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前言

蘭花跟所有植物一樣，於栽培過程中都可能面臨病蟲害之威脅，而導致生長與

品質上之損失。對於大多數感染蘭花之病害而言，只要運用傳統的防治方法例如施

用藥劑，均可獲得良好之防治效果，唯獨由「濾過性病毒」 (virus) 所感染之病毒

病至今仍缺乏有效之治療對策。跟所有作物一樣，要栽培完美無缺之蘭花，起始於

無病之健康種苗為不二之法門。以我國現今之蝴蝶蘭產業為例，約有二成之種苗乃

利用親本授粉所結之種子繁殖而來，稱為「實生苗」，其餘約八成之種苗乃藉由無

性組織培養技術，將優良性狀之植株大量複製成為具有完全相同性狀之種苗，這種

種苗稱為「分生苗」。不過分生苗雖然可以複製其親本植株之所有優良性狀，但也

可能繼承其親本所感染之「病毒病」，而影響後續之栽培、生育與開花品質。因此

優良性狀之蘭株必須經過病毒檢測程序，確定無病毒感染後，才能進行分生組織培

養大量複製分生苗，此種程序已成為現今國際蘭花產業界之普識作為。

感染蘭花最普遍的二種病毒 ORSV 及 CymV 主要藉由傷口入侵感染，二者

性質非常穩定，可在細胞外存活極長之時間，因此容易污染栽培環境、器具與人員。

部分蘭花品系感染病毒後於幼年期並不表現明顯病徵，容易導致栽培者的忽略，增

加病毒傳染的機會。近年國際間蘭花品種交流頻繁，也助長了病毒之散佈。尤其產

業界全面應用組織培養技術複製分生苗，加上業者對於病毒檢測之忽略，使得近年

來帶病毒之蘭花種苗在市場上極為普遍，相對也造成買方在選購時趨於保守，此現

象對於蘭花產業之進一步發展有所不利。

因此病毒病可說是目前最困擾蘭花產業的病害，多項調查報告顯示感染情況最

普遍，對全球蘭花產業影響最嚴重的是 CymV及 ORSV。要確實執行種苗之病毒驗

證，必須仰賴敏感及有效率之病毒檢測技術，才能準確篩選感染病毒之植株。過去

二十年來國際上最廣泛應用於植物種苗病毒檢測之技術為酵素連結抗體吸附法

（ Enzyme-linked immunosorbent assay, 簡稱 ELISA ）。農業試驗所多年來也一直

以 ELISA 技術協助國內蘭花產業進行病毒檢測。然而近年來多項研究證據顯示蘭

花受到病毒侵入後常會呈現潛隱性感染，於病組織中僅累積尼C量之病毒，因而超

出 ELISA 之偵測範圍，導致漏檢之情況發生。本試驗目的為使用real-time PCR方

法分析蝴蝶蘭感染CymV，由於real-time PCR反應之高敏感度，此PCR流程對於經

ELISA 測定為負反應之蘭花樣品中仍可順利偵測到病毒訊號。

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前人研究

一、 蝴蝶蘭之簡介

蝴蝶蘭為蘭科植物中最具觀賞性的的蘭花之一，分類上屬蘭科蝴蝶蘭屬，該屬

有九個亞屬，約 50-60 種原生種，原生種是38條染色體，而現在的栽培種多為多

倍體雜交種。花朵優美似蝴蝶與飛蛾，中文稱之為「蝴蝶蘭」或「擬蛾蘭」。蝴

蝶蘭屬於單軸多年生著生草本蘭花姿如蝴蝶飛舞因而得名，國人對蝴蝶蘭有親切

的偏愛。蝴蝶蘭是一種單莖型蘭花，不但外型好，花的數目多，且持久性佳，有

「蘭花之后」之美譽，附著生長於高溫多濕河川海岸邊的森林樹木，色彩多種，

從純白、粉紅、黃花著斑、線都有。育種家們利用各種搜取到的珍貴原種進行人

工交配，改良出各種花色、花型，有大白花、紫紅花、黃花紅斑、紅點、紅線、

純黃、白花紅心等色彩，園藝品種大多數是由俗稱「台灣阿媽」的台灣原生種蝴

蝶蘭( Phalaenopsis amabilis var.ormosa)改良而成。

二、喜姆比蘭嵌紋病毒(CymV)之簡介

CymV為一分布全球的(+)ssRNA病毒，在分類上屬馬鈴薯X 病毒屬，外形呈長

絲狀，其顆粒大小約為13×475nm(Frowd and Tremaine, 1977; Hiruki et al., 1980)。寄

主僅限於蘭科植物，蘭花感染病毒後，會造成全株感染，且使植物生長力下降。

其病徵多出現於葉片，當寄主感染CymV後葉片會出現黃色褪色斑、條斑或色壞疽

斑點，新葉病徵較明顯。初期病徵輕微時，葉片上會出現淡黃色卵圓形或短條形

斑點，使葉片色澤黯淡不均，後期嚴重時則會造成病葉提早凋萎。病毒感染蘭花

花器部位時，初期無明顯病徵表現，但嚴重時花苞上會出現不正常突起、花瓣無

法展開、花瓣上有壞疽斑、顏色不均且提早乾枯掉落，健康植株的花期約2-3個月，

但感病植株花期則只有四週，有些甚至不到兩週(林, 2004)。目前蘭花栽培多以集

約方式栽培於設施環境下，以致病害問題嚴重，在許多蘭園中發現有CymV及ORSV

複合感染同一株蘭花的現象，而Cymv及ORSV複合感染對蘭花影響有加成作用，

病徵遠比單獨感染嚴重許多。此外，CymV在細胞外耐熱度為攝氏65~70度，在室

溫至少可以存活七天以上，又因CymV可在病株汁液中存活很久，離開寄主細胞後

又不會立即死亡，因此為一種容易利用機械傳播的病毒。密集栽培也常使植株間

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葉片經常互相重疊擠壓，當植株受外力影響(如風、澆水、噴灌、人力移動)，葉片

間經摩擦而受傷機率極大，病毒則可藉此感染。近年來廣泛使用組培方式大量培

養蘭苗，但常因母本表現病徵不明顯而被忽略，造成大量感染(陳, 1992; 位, 1995;

張, 1996; 張, 2001a; 林, 2004; Jensen,1951；Hsu,et al.,1992; Lawson and Hearon,1973;

Faccioli and Marani,1979; Brown,1985; Yuen et al.,1979)。

至今病毒感染仍無法以藥劑治療，較可能的辦法就是採取病株的生長點以組

織培養方式繁殖其分生苗，但生長點必須小於0.3mm才有較高機會獲得無病毒

苗，但由於取生長點時，仍能介由切割工具污染，因此成功機率不高(張, 1992a)。

就市售之清潔劑而言，5% NaOH是最穩定且有效者，能降低CymV感染力(李,

1990)。因蘭花病毒防治困難，目前研究多著重於病毒的偵測診斷，以利早期發現

罹病株病將其除去，以繁殖健康無病毒種苗(林, 2004)。

三、蘭花病毒病害之發生

由於台灣地處歐亞板塊和太平洋海板塊的交界帶上，且處於北回歸線貫穿的亞

熱帶，因此蘭科植物相當活躍，不僅適合熱帶型蘭花的栽培，對溫帶蘭花的培育

亦具有發展潛力(林, 1988; 林, 2004)。此外，由於蘭科植物因極具有吸引人的鮮豔

美麗多變的花朵，姿態優雅，氣味芳香而成為國內重要的觀賞花卉及經濟作物之

一。因民眾對觀賞花卉消費的增加，刺激業者的努力及政府的配合，將台灣的蘭

花推向國際花卉市場，造就今日蘭花王國的美名。蘭花之栽培模式大多是取得優

良品系之蘭花種子或分生芽後，先以組織培養方式育成小苗，再分株、切割，進

行大量繁殖。台灣蘭花產業蓬勃發展的同時，蘭花感染病毒卻一直是影響蘭花栽

培的最大障礙，病毒除了會影響蘭花的生長外，更嚴重地影響了蘭花的品質，且

防治困難。國內已發現的蘭花病毒有喜姆比蘭嵌紋病毒(Cymbidium mosaic virus；

CymV)、胡瓜嵌紋病毒(Cucumber mosaic virus；CMV)、齒舌蘭輪斑病毒

(Odontoglossum ringspot virus；ORSV)、桿形病毒(Rhabdoviruses)以及屬於Potyvirus

群的絲狀病毒屬等5類，其中CymV和ORSV兩種危害最為普遍，且CymV比ORSV

發生較為嚴重。(李, 1990; 位, 1995; 張, 1996; 林, 2004)

四、病毒偵測技術

目前偵測病毒的方法，主要分為兩大類。一是傳統的生物診斷法如指示植物接

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種法、電子顯微鏡觀察法以及抗血清檢定法等；另一則是分子生物技術之診斷如

反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)、即時偵測聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)等方法

(林, 2004)。由於栽培品種、環境、施肥管理及遺傳因子變異之影響，使蘭花在感

染病毒後，病徵的表現會有所差異，此外有很多因環境不適、微量元素缺乏、菌

類感染或蚊蟲叮咬等其他因素都可以產生疑似病毒感染的病徵。因為病徵判別不

易，所以準確的判斷蘭株是否感病成為蘭花栽培時所須注意之重點。

五、Real-time PCR之簡介

自從聚合連鎖反應(PCR)技術開發至今，幾乎是生物學門中最被普遍使用的技

術。PCR主要是運用DNA的變性、黏合及延伸等三步驟的循環，連續增幅目標DNA

片段。在人類的疾病或其他動植物的疫病蟲害檢測上，以PCR為基礎的技術都被廣

泛的應用，諸如多重聚合　連鎖反應(Multiplex PCR)、巢式聚合　連鎖反應(Nested

PCR)、逢機增幅多態型-聚合　連鎖反應(RAPD-PCR)、序列特徵化增幅區域

(SCARs)、聚合　連鎖反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)以及即時聚合連鎖

反應(Real-time PCR)等。其中Real-time PCR近年被使用的頻率逐漸提高，除了反應

時間大量的縮短之外，儀器及技術的亦不斷的創新進步，真正可以做到兼顧到準

確度、敏感度及高效率的多項優點。

Real-time PCR 跟傳統PCR 不同之處在於前者可經由光學系統去

監測反應中產物量(螢光物質)的變化而反應在電腦上，後者則必須等反

應結束後再進行洋菜膠體電泳分析。Real-time PCR 的配備主要有PCR

機器、光學系統及電腦(如圖1)。隨著技術的改良進步，Real-time PCR

在精確度及敏感度都優於傳統PCR。目前Real-time PCR 螢光系統可大

致分為「非探針型」及「探針型」。

「非探針型」的系統就是在反應中加入會與雙股DNA 嵌合而釋放

出螢光的物質， 目前最常被使用的螢光染劑是SYBR-green I， 這種物

質會嵌入在雙股DNA 的小凹槽(minor groove)而釋放出可被偵測的螢

光，所以當PCR 產物越多時，嵌入的SYBR-green I 就越多，釋放出的

螢光也就越多。

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「探針型」系統相對上就較為複雜，反應中除了要有專一性的引子

對之外，另外還要在引子對之間DNA 序列中找到具有專一性的片段來

作為探針， 如果不是目標物種來做偵測， 探針就不會雜合到核酸上，

之後也就不會釋放出螢光而被偵測到， 所以「探針型」系統的專一性

也就相對比較高。

Real-time PCR 的優點就實驗時間可以大幅縮短，也可在電腦上即

時監測實驗結果， 且鑑定的專一性、敏感度及準確度也較一般PCR 方

式為高。檢測過程不用進行洋菜膠體電泳分析， 除了可以節省時間及

洋菜膠的材料費外， 也可避免多做這個實驗所造成的污染及操作誤

差。此外， 不論使用探針或非探針的方法， Real-time PCR 皆可精準定

量，確定目標DNA 的初始濃度，這對於植物防檢疫中的抗病育種及輸

入農產品檢測方面， 特別具有意義。而傳統PCR 僅能用於定性分析，

至多能達到「半定量(semi-quantitative)的程度。甚至已有廠商開發出

手提式的Real-time PCR 機器，可在野外或田間都使用直接進行檢測。

而Real-time PCR 的缺點則是機器及反應耗材的費用相對較高，造成目

前在使用上無法達到普及化的主要原因。

六、Real-time PCR在植物病蟲害檢測上之應用

目前應用Real-time PCR在偵測植物病蟲害的例子越來越多，病害諸如馬鈴薯

晚疫病菌(Phytophthora infestans)、番茄斑點凋萎病毒(Tomato spotted wilt virus)、

葡萄皮爾斯病菌(Xlella fastidiosa)、青枯病菌(Ralstonia solanacerarum, race 3,

biover 2)、及柑橘黃龍病菌(Candidatus Liberibacter spp.)等。在害蟲的檢測上，目

前已有開發數種鱗翅目捲葉蛾害蟲、果實蠅及南黃薊馬等。

植物蟲害以蘋果重要害蟲---蘋果蠹蛾(Cydia pomonella)為例，蘋果蠹蛾是國際

上重要的檢疫害蟲，分布在許多溫帶國家，對蘋果及梨等溫帶果樹造成極大損

害，牠也被台灣列為重要的檢疫對象，近年來多次在進口蘋果中被檢出，所以開

發精確穩定而快速的鑑定方法相當重要。Barcenas等人以四種危害蘋果的重要捲

蛾(包括蘋果蠹蛾)為材料，將粒線體中的氧化還原酵素I(Mitochondrial cytochrome

c oxidase subunit I, COI)片段加以定序、比對，然後利用上述的DNA序列設計每一

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種捲葉蛾的專一引子對，利用PCR反應及螢光染劑(SYBR-green)嵌合在目標產物

上，而光學儀器偵測螢光反應，並將訊息傳到電腦上以提供即時的反應資訊，這

樣便可以快速的得到監測結果，這項偵測技術已在墨西哥的檢疫單位實際應用。

植物病害以柑橘類重要病害---柑橘黃龍病的例子來看，此病危一類分布於植

物韌皮部的特殊細菌(Candidatus Liberibacter spp.)所造成，目前有亞洲、美洲及非

洲三型，對於柑橘產業的危害相當嚴重，如何快速而精準的鑑定此病原菌在植物

檢疫或防疫上都相當重要。美國農部的研究人員於2006年發表一篇以Real-time

PCR快速鑑定柑橘黃龍病病菌的論文(Li et al., 2006)，他們以TaqMan的方法，開

發許多組的引子對及探針，快速而精準的鑑定亞洲型及美洲型的黃龍病菌，集中

他們也加入了其他柑橘病害病原體(如柑橘潰瘍病菌)來測試此技術的專一性，這

項技術的開發除了目前應用在佛羅里達州來偵測亞洲型黃龍病菌外，也可適用於

全球其他國家(汪, 2005)。

材料與方法

ㄧ、供試植物材料

本實驗使用植物材料來自嘉義大學園藝技藝中心，以肉眼觀察取樣病植再依

感病程度輕到重，分別編號和照相：0-未感染(葉片表面健康無病徵)、1-輕度感

染(葉片表面具淡淡的嵌紋)、2-中度感染(葉片表面具較多嵌紋且葉面凹凸不

平)、3-嚴重感染(葉片表面具嵌紋凹陷，葉面不平整，表面輕微褪色)、4-非常嚴

重(整片葉子褪色，嵌紋多且明顯)，如圖一。

二、試驗方法

第一節、選殖CymV coat protein gene 片段

（一）抽取CymV coat protein gene 之RNA

1.取CymV感染的蝴蝶蘭葉片0.5克，加入液態氮磨成粉狀，迅速分裝至

1.5ml 離心管。

2.加入等體積的Trizol reagen (Giobco BRL,USA)後，快速均勻混合。

3.加入等體積的chloroform，votex 30 秒。

4.於4°C下，14000rpm離心10分鐘。

5.取上清液，加入等體積的iso-propanol，在-80°C放置30分鐘。

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6.於4°C下，14000rpm離心10分鐘。

7.倒掉上清液，加入1ml 75%酒精清洗沉澱的RNA，在4°C 下以 7500rpm

離心 5分鐘。

8.去除上清液，略為乾燥後，在無菌操作台加入適量的DEPC處理過的滅

菌水，溶解 RNA pellet，置於-20°C保存。

（二）Total RNA 之純化

利用DNase I (Promega, Madison, WI, USA) 去除total RNA 中DNA 的

干擾，加入以下溶液，包括：

RNA 20 μg

RNase-free DNase I (10 U) 20 μl

10× DNase I buffer 20 μl

加DEPC H2O 至200 μl

充分混合短暫離心後，放置在37℃/30 分鐘；之後分別加入200 μl

的DEPC water 與400 μl 的phenol:chloroform:isoamyl alcohol

(25:24:1)，充分混合後以14000 rpm/3 分鐘/4℃離心後，吸取上清液，

再加入400 μl 的 chloroform:isoamyl alcohol (24:1)，充分混合後以

14000 rpm/3 分鐘/4℃離心；取上清液加入50 μl 的 3 M NH4OAc

（pH=5.2） 與 800 μl 的100% 酒精進行RNA 沈澱，放置-20℃/過

夜。翌日以14000 rpm/20 分鐘/4℃離心後，得到pellet 以 200 μl 的

80% 酒精清洗後再以14000 rpm/5 分鐘/4℃離心，得到pellet 自然乾

燥 5-10 分鐘後，以 DEPC water 溶解，放置在 -20℃ 備用。

（三）RT-PCR

使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ( P/N 4368814, ABI,

U.S.A. ) 進行Reverse Transcription PCR。

加入以下溶液，包括：

純化後之RNA 2 μg

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10×Random primer 2 μl

10×Reverse Transcription buffer 2 μl

dNTP (10mM) Mix 0.8 μl

AMV Reverse Transcriptase 1 μl

加DEPC H2O 至20 ul

充分混合短暫離心後，進行PCR 反應。PCR 程式如下：

25℃ 10 mins

37℃ 2 hours

85℃ 5 mins

第二節、構築 pGEM-Cymv vector (CymV coat protein gene 片段插入pGEMR-T

Easy Vector)

1.以PCR 方法增殖CymV coat protein gene 片段

根據NCBI 之CymV coat protein gene 序列如附錄三，以primer3 軟體設計

(websit : http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)primers 如下:

Left primer ：ctccagctgccacttactcc

Right primer：agtgttggtggagccaaga

依照前述之(三)所得到cDNA做為 PCR 之 temple。以Advantage 2 PCR

Kit (BD 639207, U.S.A )進行PCR反應，加入以下之溶液，包括：

cDNA template（100ng/ul） 2 μl

10× advantage 2 PCR buffer 5 μl

50× dNTP Mix（10mM） 1 μl

Forward primer（10uM） 1 μl

Reverse primer（10uM） 1 μl

50× advantage 2 Polymerase Mix 1 μl

Nuclease-free H2O 36.5 μl

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充分混合離心後，進行PCR 反應，PCR 程式為：

95℃ 1 min

95℃ 30 sec

68℃ 1 min 30 cycles

68℃ 1 min

取PCR 反應物10 μl 進行1% agarose 電泳分析，用ethidium bromide (0.5

μg/ml) 染色，並做核酸影像系統（VILBER LOURMAT, France）照相記

錄。

2. 純化PCR 反應物

以WizardR SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA) kit

進行PCR 反應物純化。其方法為加入等量之membrane binding

buffer，吸取至SV Mini column 中，並將mini column 套入collection

tube 上。於室溫下靜置1 分鐘後以14000 rpm/1 分鐘/4℃離心，去除

collection tube 中的回收液，加入700 μl 之membrane washing buffer

於SV Mini column，以14000 rpm/1 分鐘/4℃離心，重覆兩次。再將 SV

Mini column 以14000 rpm/7 分鐘/4℃離心後，置於新的 1.5 ml 離心

管中並加入50 μl Nuclease-Free Water 於SV Mini column 中，靜置1

分鐘後以14000 rpm/2 分鐘/4℃離心，得到純化後的DNA 片段，利

用分光光度計 (NanoDrop-1000, U.S.A.) 測定 260nm/280 nm 之吸光

值，計算DNA濃度後，貯放在 -20℃ 備用。

3. TA cloning

利用pGEMR-T Easy Vectors (Promega, USA)為載體(附錄二)，進行

T-A cloning，將CymV 的DNA 片段進行ligation。加入以下溶液：

2× Rapid Ligation Buffer 5μl

pGEMR-T Easy Vectors(50ng) 1μl

PCR product 150 ng

T4 DNA Ligase 1μl

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加ddH2O 至總體積為 10μl

充分混合離心後，放置在 4℃下過夜。

4. Electroporation

取2 μl 的ligation 後之反應物與50 μl 的competent cell (E. coli

XL-Blue)，混合均勻後，置於1mm gap 的電擊管 (Bio-Red, USA) 中，

在冰上靜置5 分鐘後，以Gene PulserⅡ Electrporation System (Bio-Red,

USA)進行電穿孔(設定電擊條件為1.8 kV)，電擊後以1 ml 的LB

medium 沖洗管中菌液，放至37℃養菌管中，以250 rpm 震盪培養1

小時修護細菌。取 100 μl 的100mM 之 IPTG

(isopropylthio-b-d-galactoside) 與20 μl 的50 mg/ml 之X-gal

(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-d-galactoside)，均勻塗於含ampicillin (50

mg/mL )的LB plate。取修護後的菌液100 μl 塗至含IPTG 和X-gal 的

LB plate，並放置在37℃達16 小時。最後挑取白色的菌落接種於1 ml

內含ampicillin (50 mg/mL )的LB medium，置於37℃，以200rpm 培養

16 小時。

5.萃取、確認及純化Plasmid DNA

將培養完成的菌液以6000 rpm 在4℃下離心2 分鐘，去除上清液

並加入50 μl 的SolutionⅠ，充分混合後靜置室溫5 分鐘；再加入100 μl

的SolutionⅡ，上下搖晃混合後靜置5 分鐘；最後加入75 μl 的Solution

Ⅲ，同樣上下混合後靜置5 分鐘。以14000 rpm 在4℃下離心10 分鐘

後，吸取上清液至新的離心管中，並加入800 μl 的100% 酒精，充分

混合均勻，再以14000 rpm 在4℃下離心10 分鐘，將得到的pellet 自

然乾燥 5-10 分鐘後，以50 μl 的 sterile H2O 溶解，並加入0.5 μl RNase

A (1 mg/ml)放置在37℃下30 分鐘。

6.利用限制酶EcoRⅠ切割處理，確認目標基因是否已經和pGEMR-T Easy

Vectors ligation。

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加入以下溶液：

DNA 1.5 μg

RE 10× buffer 2 μl

EcoRⅠ(12u/μl, Promega) 0.5 μl

BSA (2 μg/ml) 1 μl

加ddH2O 至總體積為 20 μl

充分混合後，稍微離心並放置在 37℃下3 小時。

7.取 10 μl 產物進行 1% agarose 電泳分析，再以ethidium bromide (0.5

μg/ml) 將之染色，並做核酸影像系統（VILBER LOURMAT,Germany）

照相記錄。

第三節、病毒絕對定量分析

(一) 取0-未感染(葉片表面健康無病徵)、1-輕度感染(葉片表面具淡淡的

嵌紋)、2-中度感染(葉片表面具較多嵌紋且葉面凹凸不平)、3-嚴重感

染(葉片表面具嵌紋凹陷，葉面不平整，表面輕微褪色)、4-非常嚴重(整

片葉子褪色，嵌紋多且明顯)，健康植株當作對照之葉片0.5 g，依照第

一節(一)抽取CymV coat protein gene 之RNA（二）total RNA 之純化

（三）RT-PCR方法得到CymV coat protein gene的cDNA供做定量Cymv

數目，並以pGEM-Cymv vector作為對照。

（二）Real-time PCR分析

以確認後的 pGEM-Cymv vector做為進行Real-time PCR之絕對定量

分析的對照。使用的prime是利用ABI 之 Primer Express 2.0軟體所設

計。其序列如下：

Forward：CTGGGCCAAGGCTGGTT

Reverse：AGAAGTCAAAGGCGGCAAAC

(三)CymV coat protein gene copy數計算

先將pGEM-Cymv vector 大小為3015 bp加上CymV 620 bp共計

3635bp，代入公式

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plasmid conc(ng/μl) x 109 x 6 x 1023

plasmid bp數 x 660

362 (ng/μl) x 109 x 6 x 1023

= 3635 b.p x 660

=9.05x1010

所以將 pGEM-Cymv vector DNA進行梯度濃度稀釋成1010 、109 、

108、107、106、105、104、103、102、101 ，並利用內插法求出其Ct值，

並由Ct值求出coat protein number數。

(四)使用Power SYBR Green PCR Master Mix ( P/N4367659,ABI, U.S.A.) 以

SYBR green 螢光染劑進行PCR 定量分析。加入以下溶液，包括：

2× SYBR Master Mix 12.5 μl

Forward Primer (10 mM) 0.25 μl

Reverse Primer (10 mM) 0.25 μl

cDNA (100ng) 5.0 μl

dd H2O 7.0 μl

充分混合短暫離心後，使用(ABI 7500, U.S.A.）進行real-Time PCR 之

分析。

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結果與討論

ㄧ、 結果

(一)、蝴蝶蘭感染不同程度 CymV之外觀差異

以肉眼觀察來自嘉義大學園藝技藝中心之蝴蝶蘭植株，發現植株外觀差異明

顯，容易分辨。所以根據蝴蝶蘭不同植株葉片外觀區分感染不同程度 CymV

，分成0、1、2、3、4五個等級如圖一，0-未感染(葉片表面健康無病徵)、1-輕度感

染(葉片表面具淡淡的嵌紋)、2-中度感染(葉片表面具較多嵌紋且葉面凹凸不平)、3-

嚴重感染(葉片表面具嵌紋凹陷，葉面不平整，表面輕微褪色)、4-非常嚴重(整片葉

子褪色，嵌紋多且明顯)。

(二)、構築pGEM-Cymv vector

利用PCR 方_______式選植蝴蝶蘭CymV coat protein gene，經電泳方式分析，得到620bp

處出現預期條帶，如圖二。將此條帶切割純化，並進行TA cloning 反應，用酵素切

割再次確認ligation 成功，電泳圖如圖三，最後抽取plasmid DNA。

(三)、Real-time PCR分析

先以PCR方式確認Real-time PCR之primer是否為單一條帶，結果如圖四，顯示primer

可適用於real-time PCR分析。再將感染不同程度之蝴蝶蘭樣本Plasmid DNA進行梯度

濃度稀釋為109、105、107、103製作標準曲線，如圖五，Ct值為13.8508、17.9506、

24.2242、30.4354，且回歸方程式為 Y= 38.423512+ -2.801376X而且R2=0.991380，

高出數值R2square=0.8，顯示以此 Plasmid DNA 經梯度濃度稀釋後，所製作出的標

準曲線可供作後續real-time PCR之用。另外，當進行real-time PCR分析時，其primer

解離曲線呈現單一峰值，如圖六，顯示primer可適用於real-time PCR分析。

本試驗是利用SYBR螢光定量，其原理係利用一種螢光結合蛋白SYBR Green，

結合於雙股DNA之鹼基對之間，當DNA受熱導致雙股結構分離時，SYBR Green便

游離出來，若此時予以雷射光激發之，便能產生螢光現象，將產生之螢光累積數值

量化，並作成圖形，加以分析。隨著PCR反應中模板以2n進行增幅時，螢光亦是以

2n累積，當PCR進入最後一個循環之加熱時，SYBR Green會被熱破壞，並大量衰解，

螢光累積也就在此時結束。所以當cDNA模板數多時，以相同的PCR反應循環能累積

17

到相對更大量的螢光，因此定量PCR能以被雷射激發之螢光累積量及有效增幅循環

數來判斷target gene的表現量。將蝴蝶蘭樣本DNA進行real-time PCR分析，得到蝴蝶

蘭樣本之擴增曲線如圖七。

最後將標準曲線利用內插法求得各個樣本之 Ct值及 coat protein number，

結果如下：其 Ct值介於13.6179~14.1400，coat protein number 介於

6.05 x1013~8.44 x1013，顯示不同程度的感染其數值差異不大但均較對照組之Ct值

23.3318，coat protein number 9.05x1010表現明顯，所以利用real-time PCR的方

式可以偵測到蝴蝶蘭感染微量的CymV，但不同程度的感染無法加以區分。

二、 討論

Real-time PCR優點為其是由電腦自動偵測並且分析資料；於PCR反應後不需

要再進行電泳分析，如此可減少不必要的污染及人為誤差；一次可同時偵測96個

樣品，且只需2小時就可知結果，可節省許多時間及人力，並有快速、精準及專一

等鑑定的功能。

Real-time PCR缺點為其價格昂貴，造成目前在使用上無法達到普及化的主要

原因。但隨著此項技術的使用日益普遍，反應所需的耗材及藥劑價格也可能逐步

下降，使用的花費也就越來越能被接受。

本試驗中各個樣本雖然以肉眼觀察所見病徵差異極大，但以real-time PCR分

析後發現：1-植株外觀為輕微感染，其ct值為13.9466，2-植株外觀為中度感染，

其ct值為13.6179，3-植株外觀為嚴重感染，其ct值為14.1400，4-植株外觀為非常

dilution 109 107 105 103

Ct值 13.8508 17.9506 24.2242 30.4354

Name 0(未感染) 1(輕微感染) 2(中度感染) 3(嚴重感染) 4(非常嚴重)

Ct值 23.3318 13.9466 13.6179 14.1400 13.6469

different 0 9.3852 9.7139 9.1918 9.6849

Coat protein

number

9.05x1010 6.05 x1013 7.60 x1013 5.29 x1013 8.44 x1013

18

嚴重，其ct值為13.6469，不同感染程度之蝴蝶蘭樣本ct值雖差異不大，但均較對

照組0-植株外觀為未感染，其ct值為23.3318，因此可以推測，以real-time PCR 技

術分析蝴蝶蘭感染CymV之靈敏度極佳在微量感染即可測出，但不同感染程度卻

不易加以分別。

19

附錄

圖一、

0、蝴蝶蘭樣本葉片表面健康無病徵。 1、蝴蝶蘭樣本葉片表面具淡淡的嵌紋。

2、蝴蝶蘭樣本葉片表面具較多嵌紋。 3、蝴蝶蘭樣本葉片表面嵌紋凹陷。

4、蝴蝶蘭樣本葉片表面整片葉子褪色。

20

圖二、

620bp處有預期條帶出現。

圖三、

用酵素切割再次確認ligation 成功。

21

圖四、

以PCR方式確認real-time PCR之primer為單一條帶，

顯示primer可適用於real-time PCR分析。

22

圖五、real-time PCR之標準曲線。

23

圖六、real-time PCR primer之解離曲線。

24

圖七、real-time PCR之擴增曲線。

25

附錄一

感染CyMV病徵

(蝴蝶蘭葉) 蝴蝶蘭(花)

26

附錄二

pGEMR-T Easy Vector

27

附錄三

Cymbidium mosaic virus strain Taiwan, complete genome, 5482-6153

bp(AY571289, NCBI)

1 atgggagagc ccactccaac tccagctgcc acttactccg ctgccgaccc cacctctgca

61cccaagttgg ccgacctggc tgccattaag tactcgcctg tcacctcctc catcgccacc

121cccgaagaaa tcaaggccat aacccaattg tgggttaaca accttggcct ccccgctgat

181accgtaggta ccgcggccat tgacctggcc cgcgcctacg ctgacgttgg ggcgtccaag

241agtgctaccc tgctcggttt ctgccctacg aaacctgatg tccgtcgcgc cgctcttgcc

301gcgcagatct tcgtggccaa cgtcaccccc cgccagtttt gcgcttacta cgcaaaagtg

361gtgtggaatc tgatgctggc cactaacgat ccgcctgcca actgggccaa ggctggtttc

421caggaggata cccggtttgc cgcctttgac ttcttcgatg ctgtcgattc cactgccgcg

481ctggagcctg ctgaatgcaa cggccgccct actgaccgcg aacgtgctgc gcactctatc

541gggaagtacg gcgcccttgc ccgtcagcgt atccaaaacg gcaacctcat caccaacatc

601gccgaggtca ccaagggcca tcttggctcc accaacactc tctatgctct gcctgcaccc

661cctactgaat aacgccaaac ttaataaggc gtgtggtttt ctaaagtttg tttccactac

721tggcataata tacttagcca gcttaaata

28

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