DNA提取概述 DNA提取分爲三個基本步驟,每個步驟的具體方法可根據樣品種類、影響提取的物質以及後續步驟的不同而有區別。利用研磨或者超聲破碎細胞,並通過加入去污劑以除掉膜脂。加入蛋白酶,醋酸鹽沉澱,或者酚/氯仿抽提,以除掉細胞內的蛋白,如與DNA結合的組蛋白。將DNA在冷乙醇或異丙醇中沉澱,因爲DNA在醇中不可溶而黏在一起,這一步也能除掉鹽分。另外,目前也有利用吸附過柱的方法提取DNA的商業化試劑盒。
DNA的檢測 二苯胺(DPA)指示劑能夠證明DNA的存在。在酸中加熱後,含有去氧糖的DNA水解,2-去氧核糖轉變為ω-羥基菊芋糖醛(ω-hydroxylevulinyl aldehyde),與二苯胺反應,產生藍色的化合物。DNA濃度可以利用分光光度計通過測量溶液在600nm的吸光度來計算。測量DNA純度的方法是測量DNA溶液在260和280nm的吸光度。DNA吸收260nm處的紫外光,而蛋白質吸收280nm處的。一個較純的DNA樣品應該基本不含蛋白質,因此260/280的吸光度比值應該較高。DNA也可以通過內切核酸酶切開後跑膠,與已知濃度的DNA分子量標準(marker或者ladder)對照來測定濃度。
DNA的使用 提取得到的基因組DNA包含細胞核和線粒體DNA(真核生物)以及葉綠體DNA(植物和藻類)。這些DNA可用於法醫學鑑定、診斷和系統發育研究,以及用於進一步的聚合酶鏈式反應(PCR)以獲得DNA中的特殊信息。純化得到的DNA也可用於研究DNA結構和化學性質,檢驗DNA-蛋白質相互作用,進行南方墨點法雜交,克隆和測序。 聚合酶鏈式反應 PCR
聚合酶鏈鎖反應,Polymerase chain reaction,簡稱PCR,是一種分子生物學技術,用於擴增特定的DNA片段,這種方法可在生物體外進行,不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。PCR這項技術,被廣泛地運用在醫學和生物學的實驗室,例如用於判斷檢體中是否會表現某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、基因複製,以及親子鑑定。
PCR這項技術是由凱利·穆利斯(Kary Mullis)發明,並因此在七年之後,1993年10月,獲得了諾貝爾化學獎該項殊榮。穆利斯的想法是,利用一種人工方法,和反覆相同程序的方法,並利用一種特殊的酶——即DNA聚合酶來擴增特定的DNA片段。DNA聚合酶天然存在於生物體內,在細胞分裂前進行DNA的複製。當DNA開始複製時,解旋酶將雙股的DNA分開成兩個單股。DNA聚合酶便結合在兩DNA單股鏈上,生成互補鏈。在穆利斯最初的PCR反應中,將DNA聚合酶用於體外試驗。雙鏈DNA被加熱到96℃,使得雙鏈分離成為兩條單鏈。但是在這個溫度下,DNA聚合酶被破壞,因此在每個循環的加熱步驟後必須補充新的聚合酶。穆利斯的原始PCR反應效率極低,需要大量時間和DNA聚合酶,並且在整個PCR反應中都需要人來照看。後來,由嗜熱細菌水生棲熱菌(Thermus aquaticus)體內產生的DNA聚合酶改善了這種低效的PCR反應。由於嗜熱細菌生活在溫度達到50至80 °C (122至176 °F)的間歇泉中,它的DNA聚合酶具有耐熱性。在用於PCR反應時,高溫並不能破壞這種DNA聚合酶,因此不需要不斷加入新的聚合酶,PCR反應由此變得簡單並且可以由機器操作。最初的具有耐熱性的DNA聚合酶來自於水生棲熱菌(Thermus aquaticus),因此被稱為Taq。Taq酶被廣泛用於當前的PCR操作中,Taq酶的缺點是它缺少3'->5'校正外切酶活性,因此在複製DNA時有時會出錯,造成DNA序列突變(錯誤)。從古菌中獲得的Pwo酶及Pfu酶均有校正機制,能夠大大降低PCR反應中的突變。將Taq與Pfu結合使用可以保證真實準確得擴增DNA。專利之爭 PCR技術的專利由Cetus公司持有,穆利斯發明PCR技術的時候在那個公司工作。Taq聚合酶也受專利保護。關於這個技術有幾個訴訟案,包括著名的杜邦訴訟案。製藥公司 Hoffmann-La Roche於1992年買下了專利並持有至今。在世界各地的多個司法管轄區,羅氏與Promega公司與Taq聚合酶相關的專利爭鬥仍然在繼續。法律上的爭論已經超出了PCR和Taq聚合酶專利的期限,這些專利已於2005年3月28日到期。
操作過程 PCR 用於擴增一小段已知的DNA片斷,可能是單個基因,或者僅僅是某個基因的一部分。與活體生物不同的是,PCR只能複製很短的DNA片斷,通常不超過10kbp。DNA是雙鏈分子,因此用互補DNA雙鏈的構造單位(核苷酸)來度量其大小,單位為鹼基對(base pair, bp)。某些特定的方法可以擴增40kbp左右的片斷,但是這種大小與真核細胞的染色體DNA相比仍然是很少的。例如,人的體細胞DNA含有大約30億個鹼基對。 目前應用的PCR反應需要幾個基本組成:
DNA模板(template),含有需要擴增的DNA片斷。
- 2個引子(primer),決定了需要擴增的起始和終止位置。(見下面引子一節)
- DNA聚合酶(polymerase),複製需要擴增的區域。
- 脫氧核苷三磷酸(dNTP),用於構造新的互補鏈。
- 緩衝體系,提供適合聚合酶行使功能的化學環境。
PCR反應在熱循環設備中進行。PCR儀可以將反應管加熱或冷卻到每步反應所需的精確的溫度。為防止反應體系中液體產生蒸氣,通常在反應管上加蓋加熱的蓋子(比加熱板溫度來的高),或者在反應體系表面加入一層石蠟油。
引子 特定的引子決定了所擴增的DNA片斷。引子是人工合成的短DNA片斷,一般不超過50個鹼基(通常18-25個),它們與所要擴增的DNA片斷的起始和終止區域完全互補。在「黏合」時引子結合於DNA模板的起始和終止點,DNA聚合酶結合到這兩個位置,開始合成新的DNA鏈。選擇引子的長度和熔點(Tm)要考慮許多條件。引子的熔點與PCR第一步中DNA的熔點不同,是指50%的引子與模板結合的溫度,高於這個溫度引子與模板就不能有效結合。這個溫度隨著引子長度的增加而升高。如果引子長度太短,就有可能與DNA模板的幾個位置結合,造成非特異性複製。另一方面,引子長度也受限於Tm。如果Tm太高,即高於80℃,也會導致問題,因為DNA聚合酶在此溫度下活性較低。引子最優長度通常為20到40個鹼基,熔點從60℃到75℃。有時也用到簡併引子,是一些相似但不相同的的引子的混合物。通常用於從不同的生物DNA中擴增相同的基因,因為這些基因通常都是近似但不相同的。應用兼并引子的另一種情況是根據蛋白質序列設計引子時,由於幾個不同的密碼子都能編碼一個胺基酸,通常難以判斷在DNA中究竟是哪個密碼子編碼的這個胺基酸。例如編碼異亮氨酸的引子可能使用"ATH",A是腺嘌呤,T是胸腺嘧啶,H可能是腺嘌呤,胸腺嘧啶或者胞嘧啶(關於鹼基如何編碼蛋白質,可查看遺傳密碼)。使用簡併引子在很大程度上降低了PCR擴增等特異性,這個問題可以使用遞減PCR(touchdown PCR)部分地解決。
基於上述考慮,設計引子可以採取以下原則:
- GC所佔比例為40%-60%
- 計算兩個引子的Tm,使之不相差5℃,並且擴增產物的Tm與引子的相差不超過10℃。
- 黏合溫度通常比計算的最低Tm低5℃,但是要根據經驗為不同條件下的PCR選擇不同的黏合溫度。
- 內部的具有自身互補性的髮夾結構不超過4個,其二聚體中不超過8個。
- 3'末端尤其重要,必須不含有與其他引子互補的序列,並且要與模板完全互補。
步驟 一般的PCR反應由20到35個循環組成,每個循環包括以下3個步驟:
- 熔解:利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引子完全分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘。
- 降溫或稱接合:在DNA雙鏈分離後,降低溫度使得引子可以結合於單鏈DNA上。此階段的溫度通常低於引子熔點5℃。錯誤的黏合溫度可能導致引子不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。新技術的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會高於熔點3~5℃,僅需時間5~10秒。
- 延長:DNA聚合酶由降溫時結合上的引子開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴於DNA聚合酶。該步驟時間依賴於聚合酶以及需要合成的DNA片斷長度。傳統的Taq估計合成1000bp大概需要1分鐘、較新的Tbr(來自於嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、融合型聚合酶僅約15秒。
聚合酶鏈鎖反應簡圖 (1) 96℃高溫下使雙股DNA打開 (2) 在約68℃下讓引子與DNA配對 (3) 在72℃ DNA延長 (P=聚合酶). (4) 第一循環完成,做出的兩段雙股DNA又可當作下一個循環模板,這樣每次循環都使得擴增的DNA片段加倍。
優化PCR 在實踐中,PCR可以因各種原因而失敗,部分原因是由於其對於污染的敏感性,導致擴增錯誤的DNA產物。正因為如此,人們已經開發了一些技術和步驟來優化PCR反應條件。將PCR反應前的混合物與潛在DNA污染物分開的實驗室方案和流程解決了外源DNA的污染問題。這通常包括從用於分析的區域分理出PCR的設定區域或者說PCR產物的純化,一次性塑料製品的使用,及對反應裝置之間的工作檯面徹底清潔。引子的設計技術在改善PCR產物產率和避免雜產物的形成是很重要的。替代緩衝成分和聚合酶的使用有助於較長或存在其他問題的DNA區域的擴增。在緩衝體系中加入試劑,如甲醯胺,或會增加PCR的特異性和產量。可以利用計算機模擬理論PCR結果(電子PCR),以協助在引子設計。
PCR的各種變體
- 遞減PCR(touchdown PCR):前幾循環溫度逐漸下降。
- 逆轉錄PCR(RT-PCR):以由mRNA逆轉錄而來的DNA爲模板,由此產生出來的DNA不帶有內含子(基因中不具意義的段落),常應用於分子克隆技術。
- 熱啟動PCR(hot start PCR):以高熱活化型核酸聚合酶進行反應,減少非專一性產物。
- 即時PCR(real-time PCR):PCR過程中利用螢光探針或染料定量檢測,又稱定量PCR(quantitative PCR)。
- 巢式PCR(nested PCR):先用低特異性引子擴增幾個循環以增加模板數量,再用高特異性引子擴增。
- 多重PCR(multiplex PCR):在同一個管中使用多組引子。
- 復原條件PCR(reconditioning PCR):PCR產物稀釋10倍後重新放入原濃度的引子和dNTP等循環3次,以消除產物中的異二聚體。
- dsRNA合成(dsRNA replicator):合併使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase;從雙股DNA轉錄為對應的雙股RNA(dsRNA)。可應用於RNAi實驗操作。
- COLD-PCR(co-amplification at lower denaturation temperature-PCR):用以檢測突變或特殊等位基因的PCR應用技術。
- Digital-PCR:將標準的PCR反應分割至每一個反應中僅1~2個copy。藉以偵測微小比例的基因差異。應用於:癌症突變基因、病原體檢測、藉由母血對胎兒做產前檢測。
PCR的應用
- 基因圖譜建立
- 親子鑑定
- 偵測遺傳疾病
- 複製特定基因
- 基因突變研究
- DNA遺傳演化
- 基因表現比較
鑒定基因 人體內的細胞共有有約為30億個鹼基對的DNA,每個人的DNA會有差異,具有差異的鹼基對數目達幾百萬之多,因此通過分子生物學方法顯示的DNA圖譜也因人而異,由此可以識別不同的人。所謂「DNA指紋」,就是把DNA作為像指紋那樣的獨特特徵來識別不同的人。由於DNA是遺傳物質,因此通過對DNA鑒定還可以判斷兩個人之間的親緣關係。
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