高效液相層析儀的構成組件 *A:溶劑（耗材） *B:2溶劑切換開關閥 *C:水泵 *D:壓力阻尼器 *E:Mischkammer *F:手動進樣器 *G:層析管柱（耗材） *H:高效液相色譜法控制器 *I:檢測器（紫外吸收光譜儀等） *J:檢測數據A/D轉換器（數據輸出系統） *K:電腦（用作數據記錄器數據分析系統） *L:印表機
儀器分析林志城、薛文發編著
高效能液相層析...........儀器分析林志城、薛文發編著
第一節高效液相層析儀之基本組件第二節高效能液相層析管柱的選擇第三節高效能液相層析儀之實務操作第四節高效能液相層析應用與實例.
第一節高效液相層析儀之基本組件高效能液相層析儀主要由：(1)溶媒輸送供應系統(solvent supply)；(2)高壓幫浦(pump)
； (3)
樣品注射器(injector)；(4)層析管柱(column)；(5)偵測器(detector)；(6)數據處理系統所組成(data
acquistion) （ 如圖11-1)
溶媒輸送供應系統高壓幫浦樣品注射器層析管柱偵測器 數據處理系統 HPLC儀器設備上裝有一個或一個以上的玻璃或不鏽鋼儲存器，每一個儲存器可裝500 mL或更多的移動相或溶劑，此儲存器通常裝有去除溶解氣體的裝置，通常是去除去氧氣和氮氣，這些氣體所形成氣泡會造成沖提的困擾與對偵測系統干擾。除氣器(degasser)含有真空幫浦系統、蒸餾系統和加熱及攪拌溶劑的裝置，或噴氣(sparging)系統以降低溶解度的惰性氣體形成的微小氣泡將溶液中溶解的氣體趕出；通常此系統也包括從溶劑中過濾雜質和顆粒物質的功能。
溶媒輸送供應系統計有單一溶劑式及梯度(gradient)溶劑式兩種。使用一定組成的單一溶劑系統的分離稱為等位流析(isocratic
elution)；使用二種（有時更多）不同極性溶劑的系統稱為梯度流析(gradient elution)， 在溶析(elution)開始後，二種溶劑的比率以程式方式階梯式改變，有時是連續的，有時是經一系列的步驟；溶劑的體積比可以隨時間呈現性或指數關係而變化，此種方式可縮短分析時間或提高分離效率。幫浦是產生作用力(driving
force)的來源，可將移動相輸送至整個分析管路中，通常使用往復式幫(reciprocating pump)，係由一小槽室組成，可使溶劑由馬達推動的活塞來回運動而抽取。二個球形止回閥的一開一關可控制溶劑流進或流出氣缸，此溶劑是直接與活塞接觸，相對的，壓力可經由一彈性隔膜傳遞到溶劑，再藉逆活塞油壓抽氣。HPLC幫浦應具備可提供穩定液流與無壓力脈衝(pressurepulses)的特性。壓力脈衝是基線中雜訊的來源，簡單的唧筒幫浦(piston
pumps)主體為不鏽鋼和仔細研磨的寶石構成，其進出流由止回閥控制，為降低壓力脈衝，可藉由適當切割的凸輪(cam)驅動唧筒，以提供固定流速（圖11-2）。另外使用兩個平行配置唧筒幫浦(two
single piston pumps)的雙頭唧筒(twin-headed pump)可進一步降低壓力脈衝情形（圖11-3）。往復式幫浦的優點包括：小的內部體積(35~400
μL)、高輸出壓力、適合梯度沖提以及流速固定，且不易受到管柱的逆壓及溶劑黏度的影響。Motor &Cam(突輪)Plunger(活塞) Plunger sealCheckvalvesPump head高效能液相層析分析儀最常使用樣品閥(sample
valves)載入樣品，如圖11-4，由於位於幫浦與管柱間必須承受10,000
psi的壓力。樣品閥必須載入定量的樣品進入管柱，通常會設計以定量的迴圈(loop)來達成。分析用的高效能液相層析分析儀之樣品閥容積多選用μL至數百μL，但是製備用途的高效能液相層析分析儀其樣品閥容積可能需要超過10
mL。為保持系統效率，樣品閥必須被設計成有極低分散性(lowdispersion)的特性，也就是將樣品在閥表面因吸附和脫附所造成的分散，以及閥的運作過程中，樣品進出所導致的擴散降到最低。
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層析分析管柱(analytical column)為HPLC的心臟製備型管柱(preparative
column)液相層析法的分析管柱一般是由不鏽鋼管作為外支撐擔體(support)液相層析法中的多孔性粒子填充物是由直徑範圍從3~10
μm的微粒子所組成，這些粒子由矽膠、礬土或離子交換樹脂組成，目前最常使用的是矽膠柱。於分析管柱之前通常裝置防護管柱(guard
column)，去除移動相中的顆粒和汙染物，以保護分析管柱、延長分析管柱的壽命。偵測器用以偵測沖提流出液中待測化合物之訊號或含量，一般在測定時樣品為液態或溶液的儀器，均可使用作為HPLC的偵測器。最常配備的偵測器有紫外光／可見光(UV/VIS)偵測器、螢光(fluorescence)偵測器與折射率(RI)偵測器等。理想的偵測器其反應時間短且和流速無關，應有最小的內部體積以減少帶加寬效應(zone
broadening)，且應具備適當的靈敏度和選擇性、良好穩定性與再現性、干擾訊號低、非破壞性、線性範圍長及較不易受溫度之變化影響。液相層析的偵測器可區成二種型式：總體性質偵測器(bulk
propertydetectors)：反應移動相的整體性質，如：折射率、介電常數或密度，這些性質會因溶質的存在而改變，在定量上與質量有關(mass
dependent)。溶質性質偵測器(solute propertydetectors)：反應某些溶質的性質，如：紫外吸收度、螢光或擴散電流，這些性質移動相並不具有，在定量上與濃度有關(concentration
dependent)。種類分析應配合欲測化合物的種類與特性以選擇適當的偵測器。在高效能液相層析儀最常使用的偵測器還是以紫外光／可見光偵測器為主。以所使用的比例而言，其中紫外光／可見光偵測器佔71%，螢光偵測器佔15%
，折射率偵測器佔5.4% ，其餘佔4.3%。幾種常見偵測器分述如下：紫外光／可見光偵測器 螢光偵測器 電化學偵測器 質譜儀偵測器
一般紫外光／可見光偵測器的靈敏度可達10－8 g/mL，優點是溫度效應低，易於梯度沖提，而且便宜、使用方便，可分析大部分的有機物質，所以是HPLC的基本配備偵測器。螢光偵測器的優點是靈敏度高，可達10－12
g/mL，適合作微量分析，其選擇性也比紫外光／可見光偵測器高很多，在食品分析常被利用來偵測維生素或特殊微量成分。
使用折射率偵測器的待測樣品應具有折射率才會被偵測到，在食品分析常被利用來偵測醣類；使用分子篩層析定量時最好也能考慮折射率偵測器，以獲得較佳的線性關係。電化學偵測器在生物、藥物臨床分析上相當重要，目前在環境分析上的應用越來越多。其中電導度偵測器其靈敏度可達10－7 g/mL，安培偵測器其靈敏度可達10－10 g/mL。雖然電導度偵測器和安培偵測器等電化學偵測器的靈敏度不低，但是化合物若能被電導度偵測器偵測到，除非量太低，不然亦可被紫外光／可見光偵測器偵測到；而能被紫外光／可見光偵測器偵測到的化合物，未必能讓電導度偵測器偵測到，這是因為測定方式不同所致，電化學偵測器在測量化合物時，必須含有電解質，使其產生電位變化。因此整體而言，電化學偵測器沒有比紫外光／可見光偵測器實用。新式的光電二極管矩陣偵測器(photodiode
arraydetector；PDA
detector)和紫外光／可見光偵測器非常相似，待測物須有吸收紫外光或可見光的能力，即含有雙鍵。光電二極管矩陣偵測器光學途徑設計與紫外光／可見光偵測器略有不同，樣品先通過樣品偵測槽後才進行分光，然後照射至光電二極管矩陣再量測各波長之吸收度。光電二極管矩陣偵測器不僅能提供吸收度的訊息，同時還能提供各波峰光譜，所得到的是三度空間的資訊，即滯留時間(retention
time)軸、吸收度(absorbance)軸與波長 (wavelength)軸，由光譜的訊號即可判斷波峰的純度和強度。天然物分析上大多使用光電二極管矩陣偵測器來分析，不僅可提供樣品三度空間的圖層，更能確認HPLC分析物流析出來的順序或是有無共溶析出(co-elution)現象。
最適分析條件層析圖（2D）Chrom
Type: Fixed WL Chromatogram, 280 nmInternal standardPhoto Diode Array Detector (PDA)(凹透鏡欄柵) 光二偶極陣列偵測器(對照孔洞)光線分開器重氫燈(DAD) Photo Diode Array (PDA) Photo Diode Array(PDA)PDA detector(SPD-M10AVP)Cell512 photodiodesGratingD2 / W Lamps1 nm / element
PDAdataRetentiontimeWavelengthAbsorbanceChromatogramSpectrum
最適分析條件層析圖（3D） 質譜儀偵測器高效能液相層析儀接質譜儀(massspectroscopy)簡稱LC/MS，是快速分離鑑定的高價設備，可分離並判斷混合物的樣品組成物。質譜分析主要是利用游離步驟將樣品中的化合物斷裂成快速移動的氣態離子，然後根據其質量電荷比(m/e)加以分離得質譜，此技術可提供混合物中無機和有機分析物的定性和定量組成，與各種複雜分子的物種結構。質譜儀的儀器組件配置如圖11-5所示。高效能液相層析儀串聯質譜儀簡稱HPLC/MS/MS，原理是當第一部質譜儀游離分析物成些許不同的離子峰之後，再將這些離子一個一個地導入第二部質譜儀中，最後離子被斷裂而產生一系列質譜，此技術稱為串聯質譜儀測定法(tandem
mass spectrometry；MS/MS)。高效能液相層析串聯質譜儀(HPLC/MS/MS)的應用非常廣泛，在生物分子結構分析、藥物研發及檢測、新生兒疾病篩檢、農藥殘存量檢測、食品成分分析、環境物質分析、中藥成分分析、刑事鑑定等方面，是非常方便及分析快速的儀器數據處理系統數據處理系統包括：記錄器(recorder)及積分儀(integrator)，記錄器接受偵測器傳來的電流訊號，將之轉換成波峰，再由記錄器描繪出來；配合積分儀，將波峰面積或高度以數字方式的表現。
此類系統已可由電腦作全部資訊控制與參數修改。第二節高效能液相層析管柱的選擇 液－固相層析 液－液相層析 離子交換層析 離子對層析 分子篩層析液－固相層析(liquid-solid
chromatography；LSC)是指當固定相為固體的液相層析，主要作用力為吸附(adsorption)。其固定相顆粒大小約為5~10 μm的矽膠顆粒，而面積約為200 m2/g，在矽膠顆粒表面不規則地接上-OH基，利用這些-OH基與欲分離之化合物間之作用力不同而將不同化合物分離。由於移動相不應與固定相有作用，因此移動相中若含有水或極性溶劑將使分離效果降低。由於薄層層析分析(thin-layerchromatography；TLC)移動相和固定相的組合與液－固相層析相同，因此可利用薄層層析分析分離的樣品多能使用於液－固相層析管柱分析。此外液－固相層析是唯一可以將同分異構物(isomer)分開的層析方法。適用於液－固相層析管柱的樣品條件為：低極性或有機溶劑可溶的化合物。分子量在100~2,000。無解離性。高效能液－固相層析應選用略為低極性溶劑進行沖提分離，但當分析管柱受汙染後，活性降低，此時可使用較高極溶劑如50%
(v/v)苯／甲醇除去吸附的汙染物，再以較低極性溶劑如10% (v/v)異丙醇／戊烷或100%乙醚等洗去殘留的甲醇，再調整以分析條件的移動相溶液沖提。
液－液相層析(liquid-liquid
chromatography；LLC)是指當固定相為液體的液相層析，主要作用力為分配作用(partition)。這裡所指的液體固定相指附著在均勻顆粒上之的液體。固定相液體與移動相液體不互溶，但因溶質成分會因對二種不互溶液體有分配率差異的作用，而達分離的效果。液－液相層析分析中二液相間配合適當可得適當的容量因子(capacity factor) k'值及良好的選擇性。欲以液－液相層析管柱分析之樣品溶液最好能以移動相配製，因為配製使用溶劑極性若較移動相高，每次注入管柱的微量溶劑將損傷管柱充填物，亦會導致溶解度較低的溶質沉積在管柱中內，會導致波峰拖尾及變寬。此外，液－液相層析所使用的溶劑一定需先脫氣(degas)，以免產生氣泡，而影響流速與分離效果。將化合物與支持物作化學性結合（ 如表11-1
） 的層析法稱為結合相層析(bonded-phase chromatography；BPC)，也屬於液－液相層析，具有安定、固定相不易流失的優點。溫度會影響結合層析分離效果，50~60℃是常用之溫度，提高溫度會降低黏度，增加溶質在移動相中的溶解度及改分離選擇性。
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