將誘導產生的芽、苗、癒傷組織、原球莖或胚狀體等培養物重新分割，接種到新鮮培養基上進一步擴大培養的過程稱為繼代培養，也稱為增殖培養。該過程是植物組織培養中決定繁殖速度快慢、繁殖係數高低的關鍵階段。繼代使用的培養基對於一種植物來說，每次幾乎完全相同。由於培養物在適宜的環境條件、充足的營養供應和生長調節劑作用下，排除了其他生物的競爭，繁殖速度大大加快。
1 、繼代增殖方式 根據外植體分化和生長的方式不同，繼代培養中培養物的增殖方式也各不相同。主要的增殖方式有：
（1 ）多節莖段增殖 將頂芽或腋芽萌發伸長形成的多節莖段嫩枝，剪成帶1~2枚葉片的單芽或多芽莖段，接種到繼代培養基進行培養的方法。該方法培養過程簡單，適用範圍廣，移栽容易成活，遺傳性狀穩定，如馬鈴薯、葡萄、刺槐、山芋等即可此種方式增殖。
（2 ）叢生芽增殖 將頂芽或腋芽萌發形成的叢生芽分割成單芽，接種到繼代培養基進行培養的方法。該方法不經過癒傷組織的再生，是最能使無性係後代保持原品種特性的一種增殖方式，而且成苗速度快，繁殖量大，適合於大規模的商業化生產。
（3 ）不定芽增殖 將能再生不定芽的器官或癒傷組織塊分割，接種到繼代培養基進行培養的方法。不定芽形成的數量與腋芽無關，其增殖率高於叢生芽方式。但是通過這種方式再生的植株在遺傳上的穩定性較差，而且隨著繼代次數的增加，癒傷組織再生植株的能力會下降，甚至完全消失。
（4 ）原球莖增殖 將原球莖切割成小塊，也可以給予針刺等損傷，或在液體培養基中振盪培養，來加快其增殖進程。
（5 ）胚狀體增殖 通過體細胞胚的發生來進行無性系的大量繁殖。具有極大的潛力，其特點是成苗數量多、速度快、結構完整，因而是增殖係數最大的一種方式。但胚狀體發生和發育情況復雜，通過胚狀體途徑繁殖的植物種類遠沒有叢生芽和不定芽涉及的廣泛。
一種植物的增殖方式不是固定不變的，有的植物可以通過多種方式進行無性擴繁。如葡萄可以通過多節莖段和叢生芽方式進行繁殖；蝴蝶蘭可以通過原球莖和叢生芽方式進行繁殖。生產中，具體應用哪一種方式進行，主要看他們的增殖係數、增殖週期、增殖後芽的穩定性及適宜生產操作等因素而定。
2 、影響繼代增殖的因素
（1 ）植物材料 不同種類的植物，同種植物不同品種，同一植物不同器官和不同部位，繼代紡織能力也各不相同。一般是草本>木本；被子植物>裸子植物；年幼材料>老年材料；剛分離組織>已繼代的組織；胚>營養組織；芽>胚狀體>癒傷組織。在以腋芽或不定芽增殖繼代的植物中，在培養許多代之後仍然保持著旺盛的增殖能力，一般較少出現再生能力喪失。
（2 ）培養基 在規模化生產中，培養的植物品種一般比較多，而且來源也比較複雜，品種間的差異表現非常明顯。在培養基的配製和使用上，一定要多樣化，否則會造成一些品種因為生長調節劑過高或過低而嚴重影響繁殖和生長。另外，在同一品種上，適當調整培養基中生長調節劑的濃度也是非常重要的，其目的的主要是為了保證種苗的質量，同時又可以維持一定的繁殖基數。
一些植物經長期繼代培養，在開始繼代培養中需要加入生長調節劑，經過幾次繼代後，加入少量或不加生長調節劑也可以生長。如在胡蘿蔔搏壁組織初代培養中加入10 -6m ol/L IAA才能達到最大生長量，但在繼代培養10代以後，不加IAA的培養基上也可達到同樣生長量。在蘭科植物原球莖繼代培養中情況也相同。
（3 ）培養條件 培養溫度應大致與該植物原產地生長所需的最適溫度相似。喜歡冷涼的植物，以20℃左右較好，熱帶作物需在30℃左右的條件下才能獲得較好的生長。如香石竹在18-25℃隨溫度降低生長速度減慢，但苗的質量顯著提高，玻璃化現象減少，高於25℃時，引起苗徒長細弱，玻璃化或半玻璃化苗明顯增加。另在桉樹繼代培養中發現，如果總在23-25℃條件下培養，芽就會逐漸死亡，但如果每次繼代培養時，先在15℃下培養3d，再轉至25℃下培養，生長良好。
（4）繼代周期 對一些生長速度快或者繁殖係數高的種類如滿天星、非洲紫羅蘭等，繼代時間比較短，一般不超過15d。對生長速度比較慢的種類如非洲菊、紅掌等，繼代時間就要長一些；30-40d繼代1次。繼代時間也不是一成不變的，要根據培養目的、環境條件及所使用的培養基配方進行考慮。在前期擴繁階段，為了加快繁殖速度，當苗剛分化時就切割繼代，而無需待苗長到很大時才進行繼代。後期在保持一定繁殖基數的前提下，進行定量生產時，為了有更多的大苗可以用來生根，可以間隔較長的時間繼代，達到既可以維持一定的繁殖量，又可以提高組培苗質量的目的。
（5）繼代次數 繼代次數對繁殖率的影響因培養材料而異。有些植物如葡萄、黑穗醋栗、月季和倒掛金鐘等，長期繼代可保持原來的再生能力和增殖率。有些植物則隨繼代次數而增加變異頻率，如繼代5次的香蕉不定芽變異頻率為2.14%，繼代10次後為4.2%，因此香蕉組培苗繼代培養不能超過1年。還有一些植物長期繼代培養，會逐漸衰退，喪失形態發生能力。具體表現為生長不良，再生能力和增殖率下降等。
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