http://www.hdais.gov.tw/04/research/chinese/no.19/res(c)19_37-48.pdf
花蓮區研究彙報 19:37∼48
四季蔥健康種苗快速繁殖技術1
1.分蔥潛隱病毒檢測與無病毒新梢之誘導
楊宏瑛2 鄧汀欽3 張武男4
利用免疫分析檢測分蔥潛隱病毒(SLV)在蔥苗組織內的均勻分佈，據以發展有效率的ELISA步驟，用來作青蔥健康苗繁殖體系的病毒例行檢測。試以感病之青蔥莖基盤、生長點、生長點帶一枚葉原體、生長點帶二枚葉原體等作為培植體，以培養於固態MS培養基中，只有生長點頂分生組織可獲得無病毒青蔥。對無病毒植株加速增殖方法時，TDZ與NAA同時存於MS培養基中，會減少新梢產生之數目，所以單獨添加TDZ對於誘導新梢產生之效果較佳。莖基盤經TDZ濃度1 mg/L– 5 mg/L處理42日後，約可誘導43-62個新梢，即有最佳誘導新梢數目。TDZ較BA或kinetin有較佳之效果。
1.花蓮區農業改良場研究報告第166號。本文為第一作者博士論文之一部分。
2.行政院農業委員會花蓮區農業改良場副研究員。
3.行政院農業委員會農業試驗所副研究員。
4.國立中興大學園藝系教授。
四季蔥為青蔥(Allium fistulosum L.)之一種，宜蘭地區生產面積約550公頃，因其品質佳，惟植株不易開花結子，所以一般經濟栽培只能利用分株繁殖，長期分株繁殖，部分植株出現葉片螺旋扭曲或呈現黃條斑紋之情形，類似病毒引起的病徵，部分蔥株呈現無病徵感染(symptomless infection)，但植株生長勢逐漸減弱，經濟產能降低的退化現象。目前已記載感染台灣蔥科作物的病毒種類計有洋蔥黃萎病毒 (onion yellow dwarf potyvirus, OYDV) (周, 1975；Chen and Ko, 1979)、大蒜嵌紋病毒 (garlic mosaic potyvirus, GMV) (翁與韓, 1978)、菸草嵌紋病毒 (tobacco mosaic tobamovirus, TMV) (蘇等, 1976)、大蒜潛隱病毒 (garlic latent carlavrus, GLV) (鄧等, 1991)、分蔥潛隱病毒 (shallot latent carlavirus, SLV) (Barg et al,1994)、大蒜普通潛隱病毒(garlic common latent carlavirus, GCLV) (鄧等, 1999)、韭蔥黃條斑紋病毒 (leek yellow stripe potyvirus, LYSV) (Barg et al, 1994)、分蔥黃條斑紋病毒 (shallot yellow stripe potyvirus, SYSV) (Van der Vlugt et al, 1999)、璊媒長絲狀病毒 (miteborne filamentous virus, MbFV) (Barg et al, 1994)及未經命名的長絲狀病毒等(Barg et al, 1994)。其中可能感染青蔥的僅有SLV、LYSV、SYSV及OYDV，另外據Ko與Chen (1978)報告臺灣罹患黃萎病的青蔥亦有似菌質體(MLO)的發現。
蔥科作物之組織培養研究中，以大蒜和分蔥為主，利用生長點培養除去大蒜病毒，國內外均有成果(王、黃, 1974；周等, 1989；楊, 1974；Ayabe and Sumi, 1998；Walkey et al, 1987)。至於青蔥則僅有Ohkoshi於1991的報告，切取生長點附近0.3-0.5mm的分生組織以微體培養，可得50%的成活率，而其培育成功的無病毒植株，在田間可增產67%。生長點培養的微體繁殖過程及無病毒植株種於田間繁殖時，均需追蹤調查病毒感染狀況，因此病毒檢測(virus indexing)是整個繁殖體系成功的要件。至於病毒檢定時， LYSV、SYSV、OYDV及MLO感染青蔥均有明顯病徵可以觀察，唯有SLV感染並不造成明顯病徵，需另以免疫分析檢測。
植物細胞雖然具有全能性(totipotency)，但是要發育成為一棵完整之植株，得依靠植物荷爾蒙的幫助。在新梢增殖上，近年來Thidiazuron (TDZ)被大量用於組織培養，TDZ早在1976年即被德國Schering AG公司登記為一種棉花的落葉劑。直到1982年被Mok等人在誘引萊豆(Phaseolus lunatus cv. Kingston)癒傷組織時，TDZ具有高活性，另外會誘導菸草葉圓片不定芽形成及刺激蘿蔔子葉展開(Mok et al., 1987)。TDZ比BAP或zeatin更具生理活性，在組織培養上僅需低濃度，即有一般細胞分裂素之效果，適合組織培養加速繁殖之應用(Visser et al., 1992)。TDZ之適用濃度及誘導再生途徑視作物而不同，例如在體胚發生上有洋香瓜雄不稔植株以0.1 mg/L TDZ與5 mg/L 2,4-D 的組合可誘導休眠種子之胚軸產生體胚(Gray et al., 1993)、西瓜18日未成熟胚以10 mM 2,4-D與0.5 mM TDZ組合可誘導最多之體胚(Compton and Gray, 1993)、誘導天竺葵之胚軸產生體胚(Qureshi and Saxena, 1995; Murthy et al., 1996)；器官形成上有覆盆子之新梢經10 mM TDZ與1 mM NAA誘導產生葉片(Marcotrigiano et al., 1996)、康乃馨之花瓣以0.05 mM TDZ 與0.5 mM NAA誘導產生新梢(Frey and Janick, 1991)、誘導天竺葵之根組織產生新梢(Qureshi and Saxena, 1992)等。本報告即探討組織培養技術以快速繁殖四季蔥苗，其間利用ELISA檢測病毒，以確認培養再生之小植株的健康性。
材料與方法
一、供試病毒及ELISA條件測試
自臺灣青蔥病株分離的分蔥潛隱病毒(SLV-WOtw)(Tsuneyoshi, et al., 1998)，經磨擦接種，保存於Chenopodium quinoa 及C. murale並回接(back-inoculate)至青蔥植株，待其發病取葉片組織供做試驗材料。免疫酵素分析(ELISA)供試抗體除SLV-WOtw的多元抗血清外，亦包括臺灣韭菜SLV分離株(SLV-CLtw) (Tsuneyoshi, et al., 1998)的多元抗體。其免疫球蛋白(IgG)的純化及ELISA所需試劑的製備依Clark and Adams(1977)所述。但反應進行採間接法ELISA, 係參考Koenig(1981)之方法。為測試ELISA的最適反應條件及抗原被有效檢出的最低濃度，先以健康與罹病植物葉片以10倍量 (W/V)之覆附緩衝液 (coating buffer) 研磨，並經10倍系列稀釋，每樣品各抽取0.1 ml汁液，二重複，加入微量盤各孔穴內，置4℃隔夜。以PBST清洗3次後，各孔穴分別加入以聯結緩衝液(conjugate buffer)稀釋 500 倍之SLV-WOtw與SLV-CLtw IgG各0.1ml，置於36℃作用2小時。以PBST清洗3次，各孔穴分別加入0.1ml稀釋10000倍之鹼性磷酸酵素結合之山羊抗兔免疫球蛋白(anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate, SigmaA-3687)，置於36℃作用2小時。以PBST清洗3次，再加入鹼性磷酸酵素基質溶液( b -nitrophenyl phosphate disodium, 1mg/ml)，置於36℃，反應60分鐘，以ELISA讀值機(Multiskan Plus) 測讀在波長405nm之吸收值。
二、DTBIA 檢測病毒分佈
利用直接組織印漬免疫分析(direct tissue blotting immunoassay, DTBIA) (Lin et al, 1990)檢測病毒在植株內的分佈。以研磨器加壓於感染SLV的蔥苗組織，將全株汁液印漬於0.45μm的轉漬膜(nitrocellulose membrane ,Bio-Rad)上。採樣印漬完成後需待組織液乾燥，再將轉漬膜浸泡於5%脫脂奶粉之TBST溶液中反應30分鐘。將轉漬膜移入稀釋500倍之SLV-WOtw IgG溶液(l mg/ml )中反應2小時，以TBST溶液震盪洗滌三次，每次10分鐘，再移入稀釋10000倍之鹼性磷酸酵素結合之山羊抗兔免疫球蛋白溶液中繼續反應2小時，再經TBST洗滌三次後加入BCIP/NBT呈色液 (alkaline phosphatase substrate kit, Bio-Rad)進行反應，待罹病組織對照組呈現藍黑色反應後，倒去呈色液，以自來水沖洗轉漬膜以中止反應。另以接種及未接種的蔥葉淬取液當對照樣品，經10倍系列稀釋後各以2μl印漬於轉漬膜上，同時進行點漬免疫分析(dot blotting immunoassay, DBIA) (Fukami, 1991)，以其結果當正負反應判斷之依據。
三、健康母株組織培養加速繁殖
選取無蟲害且無病徵之「蘭陽一號」青蔥植株，並利ELISA篩選無SLV或帶SLV之單株，種植於消毒過之介質中，並標記清楚。除去青蔥外葉及根，切取自莖基盤上蔥白部分約3cm，以70%酒精消毒1分鐘，再以Clorox 2.5%滴加Tween20，消毒20分鐘，經以無菌水洗滌三次後，利用解剖顯微鏡分別切取生長點、生長點帶一枚葉原體、生長點帶二枚葉原體或整個莖基盤等培植體，每種培植體以10個樣品為一重複，共10重複。分別培養在含有不同濃度(0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、5 mg/L及10 mg/L)及種類的植物生長調節劑NAA (1-naphthaleneacetic acid)、BA ( N6-benzyladenine)、Kinetin、TDZ (thidiazuron)之MS (Murashige and Skoog, 1962)培養基中，pH調至5.7±0.1，培養基中添加蔗糖30 mg/L及洋菜8 mg/L，再以高溫121℃與高壓1.2 kg/cm2滅菌20分鐘。
一、ELISA的反應條件及抗原被有效檢出的最低濃度
以間接法ELISA比較SLV-WOtw及SLV-CLtw兩種抗體對SLV的檢出效率，結果如圖一所示，在SLV感染的蔥葉稀釋至1/1000時，兩抗體皆仍有效測出抗原反應，而不與健康對照植株起反應。至於兩種抗體對SLV接種的C. quinoa 及C. murale可檢測出1/100000稀釋的寄主組織液中病毒高活性反應，顯現其可用於病毒檢定之高效率指標植物。
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圖一、SLV青蔥分離株(SLV-WOtw,圖左)及韭菜分離株(SLV-CLtw,圖左)的抗體進行免疫酵素分析檢測青蔥SLV之活性比較。
Fig. 1 ELISA results of SLV reacted with antibodies of SLV-WOtw (left) or SLV-CLtw (right) in bunching onion virus indexing.
圖二、利用直接組織印漬免疫分析檢測 SLV在蔥株組織分佈（左圖），健康(H)及SLV感染(I)的蔥葉淬液經十倍系列稀釋以點漬免疫分析之結果（左圖）
Fig. 2. SLV distribution in seeding of bunching onion detected by DTBA (left): leaf sap with ten-folded dilutions of healthy (H) and SLV infected plants in dilution serials of leaf sap (right).
二、DTBIA 檢測病毒分佈
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利用DTBIA檢測SLV在蔥苗組織的分佈結果如圖二，全株汁液印漬到轉漬膜上均有病毒反應，其中以莖基盤及蔥葉部份濃度最高。而利用點漬免疫分析汁液稀釋倍數，在稀釋百萬倍之後仍有反應。可以作為以後青蔥採取樣品及樣品用量之參考。
三、青蔥不同培植體帶病毒情形及TDZ誘導產生新梢數與生育日數之比較
經ELISA檢測帶病毒病植株，分別切取莖基盤、生長點、生長點帶一枚葉原體、生長點帶二枚葉原體，進行培養長成植株後，切取葉片分析，僅生長點分生組織為培植體之植株呈陰性反應，其餘莖基盤、生長點帶一枚葉原體或二枚葉原體皆呈陽性反應。
表一、青蔥不同培植體帶病毒情形
*The infected virus degree:－ non-infected, ＋＋medium infected.
比較莖基盤與生長點作為培植體，結果如表一，以MS培養基含TDZ誘導產生新梢及出瓶時間之比較，經0.05mg/L TDZ處理，生長點產生1.4個新梢，莖基盤產生2.3個新梢；生長點誘導產生之小苗出瓶日數較莖基盤多50日。0.1 mg/L TDZ處理，誘導生長點產生3.8個新梢，莖基盤產生6.4個新梢；出瓶日數分別為200與180日。0.5 mg/L TDZ處理，生長點增生6.3個新梢，莖基盤則產生19.2個新梢；出瓶日數分別為240與180日。1 mg/L TDZ處理，使生長點產生10.4個新梢，莖基盤產生43.3個新梢；出瓶日數分別為240與180日。TDZ濃度再提高至5 mg/L TDZ，生長點產生之新梢全部玻璃質化，而莖基盤可產生66個新梢，接種後經200日可出瓶。
表二、比較TDZ誘導青蔥生長點與莖基盤產生新梢數及生育日數之情形
Table 2. Comparison of TDZ on number of shoots and growing days from meristem and stem-disc explants of bunching onion.
四、利用組織培養技術生產無病毒病之種苗
以NAA與TDZ誘導莖基盤產生新梢之情形，切取無病毒病之青蔥蘭陽一號之莖基盤，以0、0.1、0.5、1、5、10 mg/L NAA及0、0.1、0.5、1、5、10 mg/L TDZ不同比例誘導，經二個月後調查新梢產生之結果(詳如表三)：僅有TDZ時，0.1mg/L可誘導7個新梢，隨濃度增加而增加，5mg/L可誘導62個新梢，10mg/L誘導之新梢降低至21個，乃因10mg/L TDZ誘導之新梢容易玻璃質化(圖三)，導致數目減少。 TDZ / NAA為0/0.1-0.5 mg/L則產生1個新梢，0/1-10mg/L僅誘導根部生長。0.1/0.1 mg/L約誘導4個新梢，0.1/0.5-10 mg/L降低為1個。10/0.1 mg/L約42個，10/0.5 mg/L約37個，10/1 mg/L約29個，10/5 mg/L約15個，10/10mg/L約可產生10個新梢。換言之，0.1mg/L TDZ即有誘導產生新梢之能力，但是培養基內同時含有0.5mg/L 之NAA即抑制新梢產生，隨NAA濃度增加(0.5-1mg/L)，TDZ濃度需提高至0.5mg/L才有誘導新梢之效果。5mg/L NAA之培養基內TDZ需提高至1mg/L才有誘導效果，隨著TDZ濃度提高，NAA濃度減低，莖基盤產生新梢數目增加，1-10mg/L NAA在無TDZ情形下，莖基盤僅產生根，無新梢生成。其中又以1mg/L NAA誘導產生之新根最正常，5-10mg/L產生之新根較粗甚至呈平板狀。
表三、NAA及TDZ組合對誘導青蔥莖基盤產生新梢數量之比較
Table 3. Effect of NAA and TDZ combination on shoot numbers from stem-disc explant of bunching onion.
莖基盤置於含有0.5、1及5 mg/L TDZ，每隔七日移出20個培植體，置放於含有1 mg/L之NAA，經三個月後，比較在不同濃度及時間下，誘導產生新梢之情形。TDZ處理初期莖基盤不斷膨大(圖四A)，處理時間超過二個月仍無新梢產生。經利用解剖顯微鏡觀察，5 mg/LTDZ處理20日，切除外部膨大部位後，莖基盤上已有芽體形成(圖四B)，移入1 mg/L NAA培養基即有新梢產生(圖四C)。經7日TDZ各濃度處理皆無誘導新梢之效果，經14日5 mg/L可誘導4個新梢，經21日0.5-5 mg/L分別可產生3、8及26個新梢。隨時間增加誘導之新梢數逐漸增加，至第42日，0.5 mg/L可產生19個，1 mg/L可產生43個，5 mg/L可產生62個，若處理時間延長至49日，可誘導之新梢數目與42日類似 (詳如圖五)。
圖三、TDZ 10mg/L誘導青蔥莖基盤誘導再生新梢玻璃質化情形。
Fig.3. The hyperhydricity of the regenerated shoots were treated by 10mg/L TDZ on stem-disc explant of bunching onion.
圖四、青蔥莖基盤經TDZ 5mg/L處理後再生枝梢形態變化情形，A.莖基盤處理20日後之外觀；B.切除外部膨大部分後，內部已有芽體產生；C. 42日處理後，移入1mg/L NAA，新梢快速產生。
Fig. 4. Morphological changes and multiplication in stem-disc explant were treated with 5mg/L TDZ of bunching onion. A. The morphology of stem-disc after 20 days treatment. B. After cutting outside leaf, the regenerated shoots were seen. C. After 42 days TDZ treatment and transfer to 1mg/L NAA, the regenerated shoots.
圖五、細胞生長素類型及濃度對青蔥之莖基盤誘導新梢之情形
Fig. 5. Effect of cytokinin types and concentration on number of shoots per stem-disc explant of bunching onion in vitro.
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圖六、青蔥莖基盤在不同濃度BA與NAA後新梢產生之情形。a與b在BA 5 mg/L；c與d在1mg/L BA； e與f在BA 0.5 mg/L；g與h不含BA為對照；處理42日後，試管a、c、e、g移入含NAA 1 mg/L培養基；b、d、f、h繼續在BA培養基中，一個月後。
Fig. 6. Comparison of the regenerated shoots of stem-discs explant treated with BA and NAA. tube a and b at 5 mg/L BA, tube c and d at 1 mg/L BA, tube e and f at 0.5 mg/L, tube g and h as check without BA. After 42days treatment, tube a, c, e and g were transfer to 1 mg/L NAA medium, tube b, d f and h were remain at BA medium, after one month the regenerated shoots were quite different.
圖七、青蔥莖基盤以不同濃度TDZ在不同處理時間誘導產生新梢之效應
Fig. 7. Effect of TDZ concentration and exposure period on shoot regeneration in stem-disc explant of bunching onion.
比較TDZ、BA及kinetin三者對青蔥莖基盤誘導新梢之效果， BA與kinetin處理後新梢產生情形較類似，在BA培養基中二個月即有新梢產生，若移入1mg/L NAA培養基產生之新
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梢更明顯(如圖六)。依據圖五結果，處理不同細胞分裂素 42日後，移至1mg/L NAA三個月後調查。在0.05mg/L TDZ、0.1mg/L BA、0.1mg/L kinetin以上可誘導多個新梢，隨濃度提高，新梢數隨之增加。0.5mg/L時，TDZ有19個新梢、BA有12個、kinetin有10個新梢。各細胞分裂素為1mg/L時，TDZ可誘導43個、BA可誘導29個、kinetin可誘導17個新梢，TDZ效果較佳。濃度在5mg/L時，TDZ有62個、BA有39個、kinetin有21個新梢，詳如圖七。
討論
一、青蔥病毒病與病毒檢測
病毒病是一種系統性病害，植株一旦罹患病毒病，全株各器官都受侵襲，造成產量及品質之降低，且無農用藥劑可以防治，病毒又可隨無性繁殖器官傳遞至下一代，再經媒介傳播即大量蔓延。台灣蔥科作物中大蒜病毒病發生率有報告為100% (林，1984；林、曾，1988)，經鑑定其病毒種類有OYDV、TMV、SLV、GCLV、LYSV、SYSV、MbFV等，至於先前認為造成大蒜嵌紋病的的GMV(翁與韓，1978； Lee et al., 1979)可能是LYSV等potyviruses複合感染所致(Barg et al., 1997； Bos, L. 1983；Van Dijk, 1993a)， GLV (鄧等，1991；Fukami et al., 1989； Lee et al., 1979； Sako et al., 1991；Sako et al., 1994 )已重新歸類為SLV的garlic strain (SLV-G) (Van Dijk, 1993b)，至於青蔥黃條斑紋病毒 (Welsh onion yellow stripe virus, WoYSV) (Liu et al., 1996, Van Dijk, 1993a )已重新鑑定為SYSV的一種(Van der Vlugt et al., 1999)。在台灣進行青蔥病毒檢定時， LYSV、SYSV、OYDV及MLO感染青蔥均有明顯病徵可以觀察，在組織培養起步時即可淘汰此類材料，培養當中目視植株出現病徵亦可中止繁殖，唯有SLV感染並不造成明顯病徵，需另以免疫分析檢測。SLV寄主範圍包括大蒜、蔥、洋蔥及韭等蔥科作物，在大蒜軟骨品系有較高的發生率(鄧，1991)，青蔥與大蒜交互感染的機會很高，且呈無病徵系統性感染，多年後感病株即有生長退化的現象。又SLV在台灣的蔥及韭上都有分離出來之記錄(鄧，1991；Barg et al.,1994；Tsuneyoshi et al.,1998)，且各分離株之間均有共同的血清反應，因此利用其中一種抗體即可檢測所有的SLV型系，本試驗亦證實利用SLV-WO 或SLV-CL的抗體都可經ELISA測出蔥株內的SLV，且在檢體稀釋1/10 - 1/1000之間皆為有效濃度，因此例行的病毒檢測時檢體定量只要在此範圍內即可。同時經DTBIA顯示SLV罹病蔥苗全株組織均有病毒反應，因此在病毒檢測時並不會因為採樣的偏差造成偽陰性(false-negative)的結果。
二、利用組織培養技術生產無病毒病之種苗
無性繁殖之植物營養體一旦感染病毒後，往往造成收量及品質低落，而生長點或莖頂培養，為去除其體內病毒可行方法。本研究以感病之青蔥莖基盤、生長點、生長點帶一枚葉原體、生長點帶二枚葉原體等作為培植體，由於病毒之分佈以維管束為運輸之途徑，而莖基盤或葉原體基部已有維管束分佈(王與黃，1974；Roberts et al.,1997)，試驗結果僅以生長點頂分生組織為培殖體，可獲得無病毒青蔥。利用TDZ誘導經240日培養每個生長點最多可產生10.4個植株，相較於田間無性繁殖約可生產27株，生產速率較低，張氏(1997)指出健康種苗之增殖量必需能高於病原之再感染率，才能取代田間已感病之個體，降低田間病原密度，達到延緩病害流行之效果，因此種苗能否大量快速生產乃防治能否成功之關鍵。而在分蔥及大蒜之研究，分別指出切取莖基盤作為微體繁殖之材料，比切取生長點有較多之新梢生成(陳，1997；Ayabe,1998)。青蔥利用莖基盤為培植體，則經200日培養，每個莖基盤可產生66個植株(如表一)，明顯較生長點生產量為高。若無法獲得無病毒植株，則挑取生長點置放於MS培養基發育成植株需60日，再切取莖基盤，即可誘導40-60個植株，整個時期約240-260日與生長點直接誘導產生新梢時間相同，新梢數目卻增加4至6倍。
TDZ被大量用於多種作物，在蔥科作物僅分蔥莖頂培養(陳，1997)，表二結果顯示0.1mg/L TDZ即有誘導產生新梢之能力，但是TDZ與NAA同時存在一個培養基中，會減少新梢產生之數目，所以單獨使用TDZ對於誘導新梢產生之效果較佳。由圖五得知，莖基盤經TDZ處理42日即有最佳誘導新梢數目。與Lu(1993)指出植物在TDZ的培養基中最好不要超過8星期一致。不同細胞分裂素對青蔥莖基盤誘導新梢之效果比較試驗顯示，TDZ較BA或kinetin有較佳之效果，各細胞分裂素為1mg/L，TDZ可誘導43個、BA可誘導29個、kinetin可誘導17個新梢。5mg/L時，TDZ有62個、BA有39個、kinetin有21個新梢(如圖七)。因為TDZ不易被cytokinin oxidase分解，且較BAP或zeatin具生理活性(Lu，1993)。
本計畫承蒙行政院農業委員會補助，國立台灣大學園藝系許教授圳塗斧正，國立中興大學植物系林教授金和提供TDZ藥劑及園藝系曾教授夢蛟指導挑取生長點等技術使實驗得以順利進行，謹致謝忱。
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