9/05第三葉長完成(30D)=20日長3葉=7日長一葉
8/31-- 第三葉(26D)
8/25--第二葉(20D)
8/23--第一葉(18D)
8/20--出葉尖(15D)
8/14-8/18 出葉柄(12D)
8/05 - 8/14 芽膨脹(10D)
植物病毒脫除技術與原理
多數農作物，尤其無性繁殖的植物，易受病菌侵染。最嚴重的如草莓，能感染62種病毒和類菌原體，因此須常更新母株。蘭花同樣易感染病毒，這也是蘭花外銷主要障礙之一。要除去植物病毒最好的方法是利用種子繁殖，原因是大部份病毒不能通過種子來傳播。可這方法對蘭花生產不合適，因為有保持品質需要，現行蘭花繁殖多採用分生苗。如何利用組織培養技術來進行蘭花脫毒，才是現實可行的方案。
脫毒技術的產生源自於人們對病毒在植物體內分佈不均勻的認識。1940年人們就發現根莖頂端分生組織與植物其他部分相比病毒含量較低，後來就有人嘗試將莖尖頂端無毒部分切下，通過組織培養的辦法進行繁殖。利用這樣方法Morel等人1952-1955年獲得了大麗花、天竺葵、馬鈴薯無毒植株。雖然如此，有些植物品種頂端分生組織仍有病毒，莖尖脫毒難以奏效。後來，1956年Thomas採用分生組織與熱處理相結合的方法，脫毒效率大為提高。到1970年代，植物原生質體培養技術的發展，又為植物脫毒技術提供了新的途徑。
一 脫毒技術及其原理
（1）莖尖（根尖）組織培養脫毒法
莖尖（根尖）培養之所以能脫毒，是因為植物幼嫩的新生組織與器官中病毒含量較低，生長點前端0.1 -1.5mm 區域內幾乎不含病毒或含量很少。這種現象有多種可能的原因，一種可能是莖尖（根尖）分生組織中胞間連絲發育不完全，病毒在細胞間的擴散受阻; 再者可能是植物莖尖（根尖）細胞分裂過快，病毒復製、擴散速度趕不上莖尖生長速度，結果莖尖（根尖）頂端細胞沒有病毒; 還有原因可能是莖尖（根尖）分生細胞有抑制、鈍化病毒的物質，或者是缺少病毒增殖感受點。
莖尖培養脫毒方法是在解剖鏡下，用鋒利的解剖刀準確地切取莖尖（根尖），然後將莖尖（根尖）分生組織進行離體培養，再結合病毒檢測，就可以獲得無病毒的植株。
莖尖培養中最主要的影響因素就是切取莖尖（根尖）的大小，一般要求莖尖（根尖）長度小於1mm。技術上通常切取莖尖（根尖）越小，脫毒效果越好，但是莖尖（根尖）培養成活率變低。
（2）莖尖微芽嫁接脫毒
對一些組培困難的植物，莖尖截取太小培養不易成功。新的變通方法是在試管中將莖尖嫁接在無毒的砧木上，進行試管培養，愈合成完整的脫毒植株。這種方法在柑橘、蘋果、葡萄等有較多應用。
（3）熱處理法
熱處理脫毒是根據病毒與植物細胞對高溫的忍耐程度不同，將苗木、接穗或種子放在適當的溫度下處理一段時間，將植物組織中病毒部分地或完全地鈍化而控制其的活動，但很少傷害甚至不傷害植物組織，從而讓植物細胞繼續保持活力加快生長，使生長點附近不帶病毒，從而達到脫毒的目的。
熱處理法是利用病毒和寄主植物對高溫的忍耐性的差異，鈍化病毒，其過程很復雜，與很多因素有關。其中，病毒對溫度敏感性、寄主植物的保衛反應均有可能起一定的作用。
熱處理法中，最主要的影響因素是溫度和時間。熱處理可通過熱水浸泡或濕熱空氣進行。熱水浸泡對休眠芽效果較好，濕熱空氣對活躍生長的莖尖效果較好，既能消除病毒又能使寄主植物有較高的存活機會。熱空氣處理比較容易進行，把旺盛生長的植物移入到1個熱療室中，在35~ 40℃下處理一段時間即可，處理時間的長短，可由幾分鐘到數月不等。熱處理的方法有恆溫處理和變溫處理，處理的材料可以是植株，也可以是接穗。
有些植物對高溫敏感，可用冷處理代替熱處理結合莖尖培養來脫毒。如三葉草，將植株放在10oC中經過一段時間培養，再取莖尖脫毒培養。同樣方法也有人用於消除馬鈴薯梭狀塊莖類病毒。
（4）抗病毒藥劑法
目前尚無一種藥劑能完全消除植物體內病毒，但可用一些抗病毒藥劑影響病毒RNA的複製形成，干擾病毒的正常生長，從而達到在組織培養中除去病毒的目的。Ribavirin是人工合成的對DNA病毒或RNA病毒有廣譜作用的一種抗病毒醚，有被用來清除蘋果中CLSV病毒。另外常用的抗病毒化學藥物有三氮唑核苷（病毒唑），5-二氫尿嘧啶（DHT）和雙乙醯-二氫-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）。這些藥物常常通過直接注射到帶病毒的植株上，或者加到植株生長的培養基上。這種方法一般要與莖尖培養相結合應用。經過抗病毒藥劑處理的嫩莖，切取莖尖，再進行組織培養，就會提高脫毒率和成活率。
採用病毒抑制劑與莖尖培養相結合的脫毒方法，可以較容易的脫除多種病毒，而且這種方法對取材要求不嚴，接種莖尖可大於1mm，易於分化出苗，提高存活率。
很多植物病毒用一種方法難以奏效，實際工作中常常是幾種方法相互結合。如使用化學藥劑和熱處理結合，可提高脫除病毒的效果。其他有效方法，如利用種子、花藥、胚珠部分，培養無毒苗，對蘭花不適用，這里不作介紹。二 脫毒效果的檢測方法
盡管我們在脫毒過程中，做了很多清除病毒的處理，取莖尖時也足夠小心，培育出的苗木也仍然可能夾帶有病毒植株。糟糕的是很多植物病毒有一個滯後的復甦期，你很難在小苗期辨別出來。因此，一個有效病毒檢測方法是脫毒成功的重要保證。
檢驗植物病毒方法隨生物科技進步不斷改進。最簡單方法是檢查葉和莖是否有病毒特有的症狀。因症狀出現可能要經過相當長的時間才能表現出來，人們就選擇一些對待檢病毒敏感的植物作為指示植物，然而將受檢植物汁液塗抹在指示植物的傷口上，即進行病毒的汁液傳染，傳染過的指示植物經過培養，會較快地顯示病毒症狀。對蘭花而言，多項調查報告顯示，感染情況最普遍，對全球蘭花產業影響最嚴重的，為蕙蘭嵌紋病毒(CyMV)及齒舌蘭輪斑病毒（ORSV）。這兩種病毒相應的常用指植物為紅藜和千日紅，症狀為紅色或黃色斑點。這就是常說的生物鑑定法。指示植物法简便易行，成本低，但它灵敏性差，所需时间长，难以区分病毒种类，況且還有一些植物病毒長期潛伏不表現出症狀，這就需要血清法、電鏡法、PCR技術。
抗血清鑒定法要進行抗原的製備(包括病毒的繁殖，病葉研磨和粗汁液澄清等)，抗血清的採收、分離等。血清可分裝到小玻璃瓶中，貯存在–15~–25℃ 的冰凍條件下。測定時，把稀釋的抗血清與未知的病毒植物汁液在小試管內混合，這一反應導致形成可見的沉澱，然後根據沉澱反應來鑒定病毒。此法靈敏度高，獲得檢測結果迅速，是目前檢測病毒的一種好方法。島內已有酵素連接抗體，可進行蕙蘭嵌紋病毒(CyMV)及齒舌蘭輪斑病毒（ORSV）免疫測定（ELISA法），結果準確可靠。
血清學反應，如果植物體內病毒含量較低，則靈敏度不夠。近年來迅速發展的PCR技術則可以檢測很少量病毒分子。對那些已知其核酸序列的病毒，可以人工合成特異的引子，通過PCR快速擴增目標病毒基因，迅速確定病毒存在與否。幸運的是進行蕙蘭嵌紋病毒(CyMV)及齒舌蘭輪斑病毒（ORSV）PCR測定的引子國外已有公開發表，只要一個簡單實驗室即可完成。
此外，PCR微量板雜交法、蛋白質電泳法、嫁接檢測法、 電子顯微鏡檢定法等也可以用來檢測植物病毒，限於篇幅不在這里介紹。當然，上述三種方法正確運用，可以有效地幫助我們篩選出無病毒的蘭花植株。
三 無病毒原種的保存
無病毒植株不具備額外的抗病毒能力，它們在污染環境中有可能會很快再次感染病毒。為避免再次感染應對溫室和栽培介質進行消毒滅菌。大規模繁殖育苗時，應該種植在與其他苗木相隔離的區域內，使該區域很少或完全沒有重新感染的機會。通過脫毒檢驗的原種可進行離體培養，長期保存繁殖。
通過莖尖培養得到的植株一般不發生或較少有變異，但還是應該檢查脫毒苗木是否保持了原有的遺傳品質。
病毒脫除是保持蘭花種質的一項重要工作，我們可共同合作，克服這個蘭花發展的障礙，讓臺灣蘭花有更廣闊國際市場。
-------------------------------------------------------------------------------
*草莓熱處理－分生組織培養脫病毒技術
草莓脫毒傳統上採用熱處理培養箱，在35 -38℃ 條件下持續對種蕾處理5～6週，使病毒鈍化失活。 但由於熱處理要求條件高，處理時間長，手續麻煩，費工費事，處理苗數少，成本高，而且只能去掉部分病毒，在生產上難以應用。近代生物技術的發展和日趨成熟，我們採用改良熱處理結合分生組織培養方法，成功地獲得了徹底脫毒的種苗。 即把切取的草莓芽洗淨後先經過高溫短時間熱處理，殺死部分病毒；然後在無菌條件下對經過處理的材料，在解剖鏡下解剖，切取分生組織尖端0.2 -0.3m m生長點，迅速接種到最佳啟動培養基上，在25℃ 下暗培養。 待長出癒傷組織後轉入光培養，接種到另一種叢芽培養基上，即產生叢生芽及綠苗。將綠苗接種在生根培養基上，20天后待根長2 -5c m時即可煉苗移栽，成活率達到95%以上。可提供縣級繁殖基地繁殖出50-100倍脫毒原原種苗。
在組織培養快速繁殖技術上，經過4年上百次培養基配比優化試驗，研製出分別最適於脫毒起動培養啟動培養基，脫毒苗叢生芽大量繁殖的叢芽培養基和脫毒苗生根、壯苗的生根培養基。從而使脫毒苗繁殖速度達到每年20萬試管苗的水平，完成了從草莓脫毒到試管苗快速繁殖、大量應用於生產的技術配套成龍。
*草莓脫毒苗的增產效果
根據多年資料，脫病毒苗在生產上有以下5個優點：
(1)生長快，長勢旺，莖葉粗壯，抗病，耐高溫，抗寒能力強；
(2)植株花序數、座果率平均增加50%左右。 無畸形果；
(3)果子外觀好，色澤鮮紅，均勻整齊，果子大，最大單果重60 -100g ，比一個雞蛋還大；
(4)結果期長，邊成熟邊開花，結果期延長20- 30天。 有利於分批上市，減少了因草莓採果期太集中所造成的積壓損失；
(5)產量高，經濟效益好。每畝可增產1000kg ，平均畝產1500 -2000kg ，果實收入7500-10000元。 結果後可繁殖出20倍種苗，售苗收入5000-10000元。
*建立脫病毒草莓三級良種繁育體系 ----
A原原種苗繁殖基地，承擔兩個方面的工作：
(1)根據生產需要，每年從脫毒培養繁殖中心預訂一定數量的試管苗，繁殖原原種苗；
(2)脫毒試管苗的育苗繁殖工作，採用網室隔離防病毒感染，大量繁殖出原種大苗，供應脫毒原種苗示範生產基地。
B原種苗生產基地，主要任務有3個：
(1)脫毒原種苗的高產示範和栽培技術培訓；
(2)在原種苗示範生產的同時大量繁殖出一代苗供應村科技戶、生產單位或果農；
(3)每年從脫毒原種繁殖基地預訂一定數量的脫毒原種苗，繁殖生產一代 苗。
C生產苗基地，主要任務有3個：
(1)脫毒一代苗的大面積生產和示範；
(2)不斷改進栽培技術，取得高產，高效益；
(3)每年從脫毒一代苗示範生產基地預訂一定數量的脫毒一代苗，在大 面積生產和示範的同時，繁殖出大量生產苗，供應廣大果農應用於生產。
*在建立脫毒苗良種繁殖體系的同時，應以科學的態度向廣大果農宣傳，脫毒草莓苗在大田生產條件下，會重新感染病毒，一般情況下的感染速度為每年10%-20 %。 因此，廣大果農在應用脫毒生產苗2-3年後，即自行淘汰。重新引進脫毒生產苗，才能一直保持較好的脫毒效果，從而確保較高的增產效益。
-------------------------------------------------------------------------------
留言列表
