*草莓熱處理-分生組織培養脫病毒技術
草莓脫毒傳統上採用熱處理培養箱,在35 -38℃ 條件下持續對種蕾處理5~6週,使病毒鈍化失活。 但由於熱處理要求條件高,處理時間長,手續麻煩,費工費事,處理苗數少,成本高,而且只能去掉部分病毒,在生產上難以應用。近代生物技術的發展和日趨成熟,我們採用改良熱處理結合分生組織培養方法,成功地獲得了徹底脫毒的種苗。 即把切取的草莓芽洗淨後先經過高溫短時間熱處理,殺死部分病毒;然後在無菌條件下對經過處理的材料,在解剖鏡下解剖,切取分生組織尖端0.2 -0.3m m生長點,迅速接種到最佳啟動培養基上,在25℃ 下暗培養。 待長出癒傷組織後轉入光培養,接種到另一種叢芽培養基上,即產生叢生芽及綠苗。將綠苗接種在生根培養基上,20天后待根長2 -5c m時即可煉苗移栽,成活率達到95%以上。可提供繁殖基地繁殖出50-100倍脫毒原原種苗。為了鑑定脫病毒效果,委託南京農業大學園藝系,用日本引進的草莓病毒鑑定品種對盆栽試管苗進行小葉接法鑑定。 證明脫毒苗已沒有任何病毒,脫毒效果好。為了進一步確認脫毒效果,進行病毒電境鑑定。 經電鏡病毒檢查,攝成照片,沒有發現病毒粒子,脫毒徹底,而且草莓細胞結構正常。 各種細胞器均完好。在組織培養快速繁殖技術上,經過4年上百次培養基配比優化試驗,研製出分別最適於脫毒起動培養啟動培養基,脫毒苗叢生芽大量繁殖的叢芽培養基和脫毒苗生根、壯苗的生根培養基。從而使脫毒苗繁殖速度達到每年20萬試管苗的水平,完成了從草莓脫毒到試管苗快速繁殖、大量應用於生產的技術配套成龍。
*草莓脫毒苗的增產效果 根據多年資料,脫病毒苗在生產上有以下5個優點: (1)生長快,長勢旺,莖葉粗壯,抗病,耐高溫,抗寒能力強;(2)植株花序數、座果率平均增加50%左右。 無畸形果;(3)果子外觀好,色澤鮮紅,均勻整齊,果子大,最大單果重60 -100g ,比一個雞蛋還大;(4)結果期長,邊成熟邊開花,結果期延長20- 30天。 有利於分批上市,減少了因草莓採果期太集中所造成的積壓損失;(5)產量高,經濟效益好。每畝可增產1000kg ,平均畝產1500 -2000kg ,果實收入7500-10000元。 結果後可繁殖出20倍種苗,售苗收入5000-10000元。
*建立脫病毒草莓三級良種繁育體系 一個高新技術成果項目能否在生產上成功地應用,產生長期的經濟效益和更大的社會效益, 取決於兩個方面:第一是項目的技術含量和實際的增產效益。 第二是有一套完整可靠的技術管理體系,保證按成果的技術要求實施。 這兩者相輔相成,缺一不可。 但是還需要建立與其配套的草莓脫毒苗三級良種繁育體系。 這是美國、日本、加拿大一直應用的經驗,也是我國一直強調實施的技術體系。第一級:脫毒原原種苗繁殖基地,承擔兩個方面的工作:(1)根據生產需要,每年從脫毒培養、繁殖中心預訂一定數量的試管苗,繁殖原原種苗; (2)脫毒試管苗的育苗繁殖工作,採用網室隔離防病毒感染,大量繁殖出原 種大苗,供應鄉脫毒原種苗示範生產基地 第二級:原種苗示範生產基地,主要任務有3個:(1)脫毒原種苗的高產示範和栽培技術培訓;(2)在原種苗示範生產的同時大量繁殖出一代苗供應村科技戶、生產單 位或果農 (3)每年從縣級脫毒原種繁殖基地預訂一定數量的脫毒原種苗,繁殖生 產 一代苗。 第三級:種苗生產基地,主要任務有3個: (1)脫毒一代苗的大面積生產和示範 (2)不斷改進栽培技術,取得高產,高效益; (3)每年從脫毒一代苗示範生產基地預訂一定數量的脫毒一代苗,在大面積生產和示範的同時,繁殖出大量生產苗,供應廣大果農應用於生產。在建立脫毒苗良種三級繁殖體系的同時,脫毒草莓苗在大田生產條件下,會重新感染病毒,一般情況下的感染速度為每年10%-20 %。 因此,廣大果農在應用脫毒生產苗2-3年後,即自行淘汰。重新引進脫毒生產苗,才能一直保持較好的脫毒效果,從而確保較高的增產效益。--------------------------------------------------------------
植物病毒脫除技術與原理
多數農作物,尤其無性繁殖的植物,易受病菌侵染。最嚴重的如草莓,能感染62種病毒和類菌原體,因此須常更新母株。蘭花同樣易感染病毒,這也是蘭花外銷主要障礙之一。要除去植物病毒最好的方法是利用種子繁殖,原因是大部份病毒不能通過種子來傳播。可這方法對蘭花生產不合適,因為有保持品質需要,現行蘭花繁殖多採用分生苗。如何利用組織培養技術來進行蘭花脫毒,才是現實可行的方案。脫毒技術的產生源自於人們對病毒在植物體內分佈不均勻的認識。1940年人們就發現根莖頂端分生組織與植物其他部分相比病毒含量較低,後來就有人嘗試將莖尖頂端無毒部分切下,通過組織培養的辦法進行繁殖。利用這樣方法Morel等人1952-1955年獲得了大麗花、天竺葵、馬鈴薯無毒植株。雖然如此,有些植物品種頂端分生組織仍有病毒,莖尖脫毒難以奏效。後來,1956年Thomas採用分生組織與熱處理相結合的方法,脫毒效率大為提高。到1970年代,植物原生質體培養技術的發展,又為植物脫毒技術提供了新的途徑。
一 脫毒技術及其原理
(1)莖尖(根尖)組織培養脫毒法
莖尖(根尖)培養之所以能脫毒,是因為植物幼嫩的新生組織與器官中病毒含量較低,生長點前端0.1 -1.5m m區域內幾乎不含病毒或含量很少。這種現象有多種可能的原因,一種可能是莖尖(根尖)分生組織中胞間連絲發育不完全,病毒在細胞間的擴散受阻; 再者可能是植物莖尖(根尖)細胞分裂過快,病毒復製、擴散速度趕不上莖尖生長速度,結果莖尖(根尖)頂端細胞沒有病毒; 還有原因可能是莖尖(根尖)分生細胞有抑制、鈍化病毒的物質,或者是缺少病毒增殖感受點。莖尖培養脫毒方法是在解剖鏡下,用鋒利的解剖刀準確地切取莖尖(根尖),然後將莖尖(根尖)分生組織進行離體培養,再結合病毒檢測,就可以獲得無病毒的植株。莖尖培養中最主要的影響因素就是切取莖尖(根尖)的大小,一般要求莖尖(根尖)長度小於1mm。技術上通常切取莖尖(根尖)越小,脫毒效果越好,但是莖尖(根尖)培養成活率變低。
(2)莖尖微芽嫁接脫毒
對一些組培困難的植物,莖尖截取太小培養不易成功。新的變通方法是在試管中將莖尖嫁接在無毒的砧木上,進行試管培養,愈合成完整的脫毒植株。這種方法在柑橘、蘋果、葡萄等有較多應用。
(3)熱處理法
熱處理脫毒是根據病毒與植物細胞對高溫的忍耐程度不同,將苗木、接穗或種子放在適當的溫度下處理一段時間,將植物組織中病毒部分地或完全地鈍化而控制其的活動,但很少傷害甚至不傷害植物組織,從而讓植物細胞繼續保持活力加快生長,使生長點附近不帶病毒,從而達到脫毒的目的。熱處理法是利用病毒和寄主植物對高溫的忍耐性的差異,鈍化病毒,其過程很復雜,與很多因素有關。其中,病毒對溫度敏感性、寄主植物的保衛反應均有可能起一定的作用。熱處理法中,最主要的影響因素是溫度和時間。熱處理可通過熱水浸泡或濕熱空氣進行。熱水浸泡對休眠芽效果較好,濕熱空氣對活躍生長的莖尖效果較好,既能消除病毒又能使寄主植物有較高的存活機會。熱空氣處理比較容易進行,把旺盛生長的植物移入到1個熱療室中,在35~ 40℃下處理一段時間即可,處理時間的長短,可由幾分鐘到數月不等。熱處理的方法有恆溫處理和變溫處理,處理的材料可以是植株,也可以是接穗。有些植物對高溫敏感,可用冷處理代替熱處理結合莖尖培養來脫毒。如三葉草,將植株放在10oC中經過一段時間培養,再取莖尖脫毒培養。同樣方法也有人用於消除馬鈴薯梭狀塊莖類病毒。
(4)抗病毒藥劑法
目前尚無一種藥劑能完全消除植物體內病毒,但可用一些抗病毒藥劑影響病毒RNA的複製形成,干擾病毒的正常生長,從而達到在組織培養中除去病毒的目的。Ribavirin是人工合成的對DNA病毒或RNA病毒有廣譜作用的一種抗病毒醚,有被用來清除蘋果中CLSV病毒。另外常用的抗病毒化學藥物有三氮唑核苷(病毒唑),5-二氫尿嘧啶(DHT)和雙乙醯-二氫-5-氮尿嘧啶(DA-DHT)。這些藥物常常通過直接注射到帶病毒的植株上,或者加到植株生長的培養基上。這種方法一般要與莖尖培養相結合應用。經過抗病毒藥劑處理的嫩莖,切取莖尖,再進行組織培養,就會提高脫毒率和成活率。採用病毒抑制劑與莖尖培養相結合的脫毒方法,可以較容易的脫除多種病毒,而且這種方法對取材要求不嚴,接種莖尖可大於1mm,易於分化出苗,提高存活率。很多植物病毒用一種方法難以奏效,實際工作中常常是幾種方法相互結合。如使用化學藥劑和熱處理結合,可提高脫除病毒的效果。其他有效方法,如利用種子、花藥、胚珠部分,培養無毒苗,對蘭花不適用,這里不作介紹。
二 脫毒效果的檢測方法
盡管我們在脫毒過程中,做了很多清除病毒的處理,取莖尖時也足夠小心,培育出的苗木也仍然可能夾帶有病毒植株。糟糕的是很多植物病毒有一個滯後的復甦期,你很難在小苗期辨別出來。因此,一個有效病毒檢測方法是脫毒成功的重要保證。檢驗植物病毒方法隨生物科技進步不斷改進。最簡單方法是檢查葉和莖是否有病毒特有的症狀。因症狀出現可能要經過相當長的時間才能表現出來,人們就選擇一些對待檢病毒敏感的植物作為指示植物,然而將受檢植物汁液塗抹在指示植物的傷口上,即進行病毒的汁液傳染,傳染過的指示植物經過培養,會較快地顯示病毒症狀。對蘭花而言,多項調查報告顯示,感染情況最普遍,對全球蘭花產業影響最嚴重的,為蕙蘭嵌紋病毒(CyMV)及齒舌蘭輪斑病毒(ORSV)。這兩種病毒相應的常用指植物為紅藜和千日紅,症狀為紅色或黃色斑點。這就是常說的生物鑑定法。指示植物法简便易行,成本低,但它灵敏性差,所需时间长,难以区分病毒种类,況且還有一些植物病毒長期潛伏不表現出症狀,這就需要血清法、電鏡法、PCR技術。抗血清鑒定法要進行抗原的製備(包括病毒的繁殖,病葉研磨和粗汁液澄清等),抗血清的採收、分離等。血清可分裝到小玻璃瓶中,貯存在–15~–25℃ 的冰凍條件下。測定時,把稀釋的抗血清與未知的病毒植物汁液在小試管內混合,這一反應導致形成可見的沉澱,然後根據沉澱反應來鑒定病毒。此法靈敏度高,獲得檢測結果迅速,是目前檢測病毒的一種好方法。島內已有酵素連接抗體,可進行蕙蘭嵌紋病毒(CyMV)及齒舌蘭輪斑病毒(ORSV)免疫測定(ELISA法),結果準確可靠。血清學反應,如果植物體內病毒含量較低,則靈敏度不夠。近年來迅速發展的PCR技術則可以檢測很少量病毒分子。對那些已知其核酸序列的病毒,可以人工合成特異的引子,通過PCR快速擴增目標病毒基因,迅速確定病毒存在與否。幸運的是進行蕙蘭嵌紋病毒(CyMV)及齒舌蘭輪斑病毒(ORSV)PCR測定的引子國外已有公開發表,只要一個簡單實驗室即可完成。此外,PCR微量板雜交法、蛋白質電泳法、嫁接檢測法、
電子顯微鏡檢定法等也可以用來檢測植物病毒,限於篇幅不在這里介紹。當然,上述三種方法正確運用,可以有效地幫助我們篩選出無病毒的蘭花植株。
三 無病毒原種的保存
無病毒植株不具備額外的抗病毒能力,它們在污染環境中有可能會很快再次感染病毒。為避免再次感染應對溫室和栽培介質進行消毒滅菌。大規模繁殖育苗時,應該種植在與其他苗木相隔離的區域內,使該區域很少或完全沒有重新感染的機會。通過脫毒檢驗的原種可進行離體培養,長期保存繁殖。通過莖尖培養得到的植株一般不發生或較少有變異,但還是應該檢查脫毒苗木是否保持了原有的遺傳品質。病毒脫除是保持蘭花種質的一項重要工作,我們可共同合作,克服這個蘭花發展的障礙,讓臺灣蘭花有更廣闊國際市場。
雲嘉南地區為番茄主要的栽培區,依台灣農業年報資料96 年栽培面積達1,768 公頃 ,佔全國栽培面積的45.7%,常見之病蟲害如病毒病、青枯病、細菌性斑點病、根瘤線蟲、早疫病、晚疫病、黑葉黴病、銀葉粉蝨、斑潛蠅、蚜蟲、番茄夜蛾、甜菜夜蛾等。番茄的病毒病害主要有:番茄嵌紋病毒(Tomato mosaic virus;ToMV)、胡瓜嵌紋病毒(Cucumber mosaic virus;CMV)、番茄捲葉病毒(Tomato leafcurl virus ;TLCV or Tomato yellow
leaf curl virus;TYLCV)、馬鈴薯病毒Y(Potato virus Y;PVY)及番茄斑點萎凋病毒(Tomato spottd wiltvirus;TSWV),病徵依感染的病毒種類、栽培品種及環境因素而異,罹病植株葉片呈現黃綠不均的嵌紋,偶有壞疽條斑或水浸狀斑,或呈凹凸不平、皺縮、畸形,新葉顏色變淡黃、葉片縮小、變細如細繩狀或植株矮小,嚴重者生長停頓,甚至枯死,且番茄病毒病之田間複合感染情況相當普遍,嚴重時罹病株率可高達100%,造成農民嚴重損失。
目前研究顯示番茄種子會帶毒傳播的只有ToMV,其他病毒不會經由種子帶毒傳播。農民在番茄果實採收後,蒐集種子須先經由酸處理去除種子的果膠,再經過滾筒乾燥去種毛,但是仍有病毒污染種子,因育苗場或是農民育苗後,種苗就有病毒感染的植株,因此本研究擬建立番茄種子去病毒技術。蒐集市售種子共計蒐集75 個品種,包括農友種苗之農友301、明珠、雙福、新光...等39 品種;美大種苗之黃金減肥小番茄 、黃金減肥大番茄等4 品種;台灣農產公司之瀧井交配桃麗、大宮163 等8 品種;生生種苗之聖運、西施、萬人緣、黃玉等4 品種;稼穡種苗之包括大牛606、紅利601、紅利603、紅利623…等10 品種;亞蔬品種之亞蔬4、5、6…等6 品種;其他品種之台南場-金豔、地方品種-西螺黑柿、試交2 號。
種子及種苗帶病毒檢測
一、種子或種苗全量RNA 的製備
蒐集市售種子,將種子或種苗(放於1/ 2M S 培養基上萌發10天)全量RNA之製備則是將種子或種苗植株葉片於液態氮中研磨成粉狀,以Total RNA Reagent(GenMark 公司)萃取RNA,以95%酒精沉澱後溶解於無菌水中。
二、反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)偵測
針對番茄嵌紋病毒(ToMV)、馬鈴薯Y 病毒(PVY)、胡瓜嵌紋病毒(CMV)、番茄斑點萎凋病(TSWV),抽取種子RNA 進行反轉錄-聚合酶連鎖反應(RT-PCR),本實驗所使用之引子對乃是根據已知之ToMV、PVY、CMV 及TSWV 核苷酸的序列,設計專一性引子,進行RT-PCR 反應,PCR 反應後產物以電泳法進行分析,其程序乃遵照一般分子生物技術進行。
三、聚合酶連鎖反應(PCR):
針對番茄捲葉病毒PCR 檢測:
1.簡易DNA 的抽取:
取植物葉片0.2g ,加入2mlTE 緩衝液(50Mm Tris-HCl, pH8.0, 10m M
EDTA, pH8.0),磨碎離心14000g 、30 分鐘,吸取50μl 上清液至微量離心管中,至於4℃ 冰箱30 分鐘,去除上清液,再用200μl TE 緩衝液清洗微量離心管3 次,之後微量離心管上會吸附DNA,直接進行聚合酶連鎖反應(PCR)檢測。2.聚合酶連鎖反應(PCR):
番茄捲葉病毒由專一性引子對(GCP1/GCP2)國立中興大學胡仲棋老師提供,進行PCR 反應。反應完成後進行電泳法進行分析,其程序乃遵照一般分子生物技術進行。
四、種子及種苗檢測結果抽取種子DNA 進行RT-PCR 偵測TYLCV;另外抽取種子RNA 進行PCR
偵測ToMV、CMV、PVY 及TSWV,電泳結果如下:
本研究共蒐集市售番茄種子75 個品種,共計檢測75 批種子及75 批種苗,檢測方法為番茄嵌紋病毒(ToMV)、馬鈴薯Y 病毒(PVY)、胡瓜嵌紋病毒(CMV)、番茄斑點萎凋病(TSWV),抽取種子(苗)RNA 進行RT-PCR,另番茄捲葉病毒(TYLCV)抽取種子(苗)DNA 進行PCR,檢測結果種子感(污)染番茄捲葉病毒(TYLCV)2.3%,番茄嵌紋病毒(ToMV)為3.4%,胡瓜嵌紋病毒(CMV)為0.5%,馬鈴薯Y 病毒(PVY)為0.2%,並無檢測到番茄斑點萎凋病(TSWV)。種苗部分感(污)染番茄嵌紋病毒(ToMV)為3.16%,感(污)染番茄捲葉病毒(TYLCV)1.88%,並無檢測到其他病毒(表一)。
表一、番茄種子種苗帶毒率檢測 | |||||
病毒名稱 | ToMV | CMV | PVY | TSWV | TYLCV |
種子帶病毒百分率 | 3.4 | 0.5 | 0.2 | 0 | 2.3 |
種苗帶病毒百分率 | 3.16 | 0 | 0 | 0 | 1.88 |
番茄種子只會攜帶番茄嵌紋病毒(ToMV),但是在本實驗中除了TOMV 外,其他三種病毒-番茄捲葉病毒(TYLCV)、馬鈴薯Y 病毒(PVY)、胡瓜嵌紋病毒(CMV),均有檢測到,而種苗上有檢測到TYLCV,病毒到底是感染種子內部,或污染種子外皮,値得再進一步去探討。
******番茄種子去病毒技術之研究******
一、磷酸三鈉處理
蒐集番茄園中罹病毒果實,將番茄種子10 g 裝於3 ㎝×6 ㎝的紗布袋,置於不同濃度:12.5%、15%及20%的磷酸三鈉溶液浸泡,分別處理不同時間:15 分、20 分、25 分及30 分,處理完後以流水沖洗1小時,再將種子以1%次氯酸鈉消毒後,置於1/2 MS 10 天使其萌發,調查種苗發芽率及帶病毒率。番茄種子以12.5%之磷酸三鈉處理30分鐘及15%之磷酸三鈉處理20 分鐘,去病毒最為有效,完全檢測不到帶病毒之種苗,且其發芽率達95%以上。
二、乾熱處理
蒐集番茄園中罹病毒果實,蒐集種子後,略為陰乾,以乾熱處理,再將種子以1%次氯酸鈉消毒後,置於1/2 MS 10 天使其萌發,調查種苗發芽率及帶病毒率,結果,不預熱處理,以70℃ 處理72 小時,發芽率83%,種苗帶病毒率為2.5%,以48℃ 預熱處理6 或12
小時,再以68 或70℃ 處理24 小時,結果顯示不論預熱6 或12 小時,68℃ 處理的發芽率可達95%以上且種苗帶病毒率為1.2%以下;另以50℃ 預熱處理6 或12 小時,再以68 或70℃ 處理24 小時,結果顯示不論預熱6 或12 小時,68℃ 處理的發芽率可達95%以上且種苗檢測不到病毒。
另有以52~60℃ 預熱處理,再以62~70℃ 乾熱處哩,但都會影響發芽率且帶病毒率偏高,故未列於表中。由結果可知不預熱處理直接70℃ 處理三日由於發芽率偏低,不建議採用,建議以50℃ 預熱6小時後,再以68℃ 處理24 小時去病毒效果較佳,完全檢測不到帶病毒之種苗,可推薦種子生產公司採用。
留言列表