分離（isolation）、純化（purification）、繁殖（propagation）、保存（preservation）在柯霍氏法則：觀察病徵、由罹病組織分離病原、接種以及再次分離病原菌的步驟中，分離是將特定的病原微生物，以可行的方法使之與植物組織分離，但執行過程中並無法保證僅得目標微生物而無摻雜其他微生物，故應再進行純化（purification），如真菌常移植單一菌絲或單一孢子。分離或純化過程主要目標是獲得單純的微生物，所使用的方法或培養基通常未能獲得大量的微生物，故須再藉以適當養分的培養基給予適當的條件培養繁（propagation），得以獲得大量具有活力的微生物，以供接種、鑑定及研究其生物學特性。當所獲得的菌株暫時不用或無法同時掌控大量的菌株，則須尋求良好的保存方式，使之能長期保存，待有需要時可再移植獲得與保存前相同活力的菌株。（一）疑似病原之分離在地球上絶大多數物體表面會有多種的微生物存在，罹病之植物也不例外，故進行疑似病原之分離時，將罹病植物組織置放於分離培養基，若無適當的表面消毒，通常植體表面的微生物（通常與病害無關的腐生菌）會出現，干擾我們對疑似病原菌的判斷，故毒面消毒雖看來無關緊要，但操作不當常成為重要的實驗干擾因素。若罹病組織為細薄的組織，如幼根、細莖、薄葉等，常切小塊後經消毒水（如1%次氯酸鈉、0.1%昇汞水、等量95%酒精+5%次氯酸鈉…等）表面消毒後，經無菌水將消毒水漂洗掉再置於分離培養基，以去除雜菌而不損及組織內的病原菌為原則；較厚的組織如粗根、果實及微管束組織，用水洗淨並以消毒液擦拭表面後，撕開表皮，直接切取病組織(變色部位)進行分離。表面消毒的時間視所分離的菌種、組織之粗細厚薄而定。有時可以用添加多種藥劑或抗生素之選擇性培養基（selective medium）（附錄-C、D），使大部分的微生物無法生長，而某特定目標微生物得以長出。1. 組織分離法(Tissue plating method)(1) 病害標本以水洗淨瀝乾。(2) 以火燄滅菌之解剖刀切取病斑邊緣成2 -4m m之小塊(含部分健康組織及部分罹病組織約為2：1 ) 。(3) 置入盛有0.5-1%次氯酸鈉（sodium hypochlorite）消毒液之無菌培養皿，可區分為未經表面消毒、表面消毒30、60或120秒，再經無菌水漂洗 3 次，漂洗時間可為數十秒至數分鐘，視分離目標物及操作經驗而定。(4) 以火燄滅菌過的鑷子夾取一塊病組織，以滅菌的濾紙吸乾後，置入水瓊脂（附錄-A）平板中，每皿置4-5塊組織。(5)
靜置於桌面3 - 7天，觀察菌絲之生長情形。(6) 觀察過程中，以火燄滅菌的移植針，挑取不雜有細菌的菌落邊緣的菌絲塊，移入馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）平板或試管中培養。或細菌菌落以劃線法純化培養（見後述）。 實習準備材料（每組）：罹病植物、無菌培養皿2個、5%次氯酸鈉少量、無菌水適量、量筒大小各一、酒精燈、冷卻瓶、解剖刀、攝子、移植針、滅菌之吸水紙、WA8皿、PDA6管。2. 促進產孢法（induced sporulation）首先準備濕室（moist chamber）--無菌培養皿（塑膠袋或其他乾淨容器）內裝有潮濕（最好以無菌水濕潤）濾紙（或吸水紙），使容器內可保持高濕度。罹病植物組織置於濕室內1-3天，促進病原產孢。待病原菌產孢後，可直接以挑針挑起病原孢子培養。3. 寄主篩選法當罹病組織雜附有多種的微生物，並可能干擾疑似病原菌的分離，可經由適當的寄主組織篩選掉多餘的腐生菌，而使病原菌分離順利。如帶有疫病菌（Phytophthora spp.）之土壤或病組織，埋入茄子果實內部，經由上述濕室內培養1-3天待埋入物旁組織褐變，重複前述組織分離法，將茄子果實褐變組織內的疫病菌分離出來。4.
細菌的分離一般常用在細菌分離的方 法，是將植物罹病組織切開， 置於無菌水中，待細菌的菌流流出後，再利用劃線平板法（streaking platemethod），把細菌懸浮液劃在培養基平板上。 此外，也可利用稀釋平板法（dilution plate method），即可獲得單一菌落。。5. 病毒的分離是依序使用不同離心速率及條件，以達到從植物罹病組織分離病毒的目的。其中包括運用超高速離心（ultracentrifugation）、密度梯度離（density-gradient
centrifuge）等技術。病毒在經分離之後，便可進行接種，亦可利用電子顯微鏡觀察、進行血清學、核酸結構等研究。6. 線蟲的分離目前較常用的線蟲分離方法為改良式柏門氏漏斗分離法（modifiedBaermann
funnel method）、網篩法（sieving method）及離心懸浮法（centrifugal-flotation method）等。離心懸浮法特別適用在由田間土壤中分離根瘤線蟲的二齡幼蟲。改良式柏門氏漏斗分離法主要適用於由少量土壤樣本中分離出體型小且活動力強之線蟲，其方法是將土壤放在舖有兩張衛生紙的60孔目的網篩上， 在將網篩以45度角度緩慢置放於直徑7公分 的小漏斗中，以避免網篩底部產生氣泡。然後再漏斗下接一以夾子封口的橡皮管，其下再接一指形管。加蒸餾水至稍蓋滿供試土壤，靜置24小時後，即可收集下方指形管中的線蟲懸浮液。網篩法主要適用於由（二）病原微生物之純化觀念利用組織分離之執行過程中，應注意所分離之疑似病原有無摻雜其他微生物，若在此階段没有注意純化的步驟，有可能會誤導試驗結果，或待發覺得有異時，可能已經是數個月甚至數年以後了，故疑似病原菌純化的觀念應予以注意。以病毒為例，有時同一罹病株感染有2種或以上病毒，若分離病毒只是將這數種病毒顆粒自植物體內分離，並未將單一種病毒分開，若未進行純化，將嚴重影響後續的研究。真菌之純化培養常是移植單一菌絲或單一孢子，而細菌則常以單一菌落分離純化，病毒則以連續數次接種於白藜葉片造成單斑（locallesion），再取單斑分離培養，上述之微生物通常重複2-3次即可達到菌株純化的目的。（三）病原微生物之繁殖影響微生物培養的主要因子有：培養基、溫度、光線、酸鹼度及通氣性等。每種真菌（或卵菌Oomycetes）都可測試最適生長的培養基及其他培養環境條件，一般而言，PDA為最簡單廣泛使用的培養基（如附錄-B），而培養卵菌多使用蔬菜汁培養基（CV8 agar，如附錄-F），細菌多使用營養培養基（如附錄-E），但許多菌已有前人研究測試出某些適合的培養基、培養條件及處理方法，故分離純化出某些微生物後，應簡單鑑定後，去參考使用前人所推薦的方法。若要達到真菌大量產孢的目的，有時PDA並不適用，則需要較專門的培養基及處理方法，甚至同屬不同種的真菌所適用的培養基亦有所不同。如用PDA不適合用來培養尾子菌（ Cercospora spp. ）， Carrotleaf-decoction agar 被用來培養多種尾子菌，而 Peanut leaf-oatmeal agar被用來培養C.arachidicola。一種腐霉菌Pythium helicoids 並不會於CV 8a gar產生孢囊，須將之培養於CV8後，再切菌塊以無菌水漂洗再經低溫處理後，才易產生孢囊及釋放游走子。若要獲得大量的菌絲則亦可將真菌培養於液體培養基中，如PDB（potato dextrose broth）、CV8 broth均常被用於培養真菌產生大量菌絲，以供核酸或蛋白質萃取用。有些病原微生物無法於生物活體外繁殖，如白粉病菌、露菌、病毒、及一些不易培養之細菌、菌質體，此時應以活植株或部分植物器官、組織為培養基，如白粉病菌可以盆栽植物、切離葉或葉圓片來培養，但要注意後續試驗時不要摻雜了其他的微生物。培養及保存（Huang,
unpublished data）（四）病原微生物之保存當所獲得的菌株要長期保存時，最重要的目的是獲得與保存前相同活力的菌株。當欲保存的菌株並無確定有適當的保存方法時，則應選擇數種保存法，而保存前，應了解保存菌株之形態、培養性狀及致病力。下列為數種常用的長期保存方法。1. 定期移植（period transfer）：定期把尚有活力的菌移到新培養基上。輪流使用營養豐盛與低碳水化合物含量之培養基；使用菌絲生長最少但可大量產孢的培養基；宜用孢子少用菌絲；取用年輕菌絲尖端移植；培養溫度以4 -10℃可較維持久時間；絶對寄生菌以活植株或部分植物器官、組織來定期移植。培養時須注意通氣性、保存之溫溼度…等，並注意許多細菌及真菌適應腐生而失去病原性或產孢能力，亦可能變異。一般而言，定期移殖是耗費時間及勞力，但若找不到好方法也只能如此。2. 礦物油（mineral oil）：先讓微生物於試管中固態培養基上旺盛生長，再將礦物油倒入管內覆蓋於其上。使用比重0.86~0.89醫藥級礦物油，連續2次高壓滅菌後，在170℃下乾燥1~2小時。冷卻後把無菌礦物油加到培養之病原菌已生長至相當程度的培養基斜面中，約1公分高，保存在冰箱或室溫中。注意事項：油層太深會造成氧氣擴散不良；更新培養時，第一次移植因為有油的關係，會長得較慢；斜面的頂部未蓋到礦物油，培養基會乾涸；因為在油下仍繼續生長，形態、生理及產孢均有可能發生變化；產生酸或能液化培養基及對油敏感的病原菌不適合以此法保存。。3. 乾燥（dry）：一些病原微生物可於乾燥的寄主組織或培養基生存，尤其是較低溫的環境下，可維持活力達數年之久。把菌培養在培養基中。待菌落長滿後，取出培養基，放在兩層無菌吸水紙之間，置於裝有氯化鈣的乾燥箱中，0~ 20℃乾燥。乾燥後，放入密閉容器內，保存在低溼度的冰箱或室溫中。4. 保存於無菌水（storage in water）：非常簡單及實用，但非適用於所有菌，卵菌及細菌怕乾，故頗為合適。將數塊菌絲塊或細菌菌泥置7-20於盛有無菌水之螺帽玻璃試管內，並予以密封避免水蒸發致乾。要使用時，將菌絲塊取出培養，或將水中細菌劃線於NB上繁殖。5. 保存於矽膠粒（storage
in silica gel）：當無法使用低壓乾燥或液態氮保存時，可使用矽膠保存。可通過6 -20 m esh網篩大小之矽膠粒經180℃90min滅菌後，盛於可密閉之小瓶內，以10%脫脂牛奶做成欲保存之真菌孢子濃縮懸浮液，或10%脫脂牛奶與甘油1:1做作log phase之細菌菌體濃縮懸浮液，將孢子（菌體）濃縮懸浮液及盛有矽膠粒之小瓶於冰浴內預冷，將懸浮液加入盛有矽膠粒之小瓶內，約0.5-0.75%水分（約0.5ml/ 4g ），並搖動小瓶使矽膠粒與懸浮液混合均勻，再冰浴30min，於室溫2-7天後，取少量測試保存之菌有無活力，確定有活力後再密封，於4℃ 或-20℃ 保存。6. 保存於土壤（storage in soil）：含水量20%的土壤，放在螺旋蓋的瓶子或試管中，連續三天各高壓消毒一次後，加入一毫升濃孢子懸浮液，混和均勻，在蓋子鬆蓋的狀況下，室溫下乾燥一週，然後旋緊蓋子，放在冰箱中保存。更新時，取用少量土灑在適當的培養基上即可。或土壤瓊脂（soil agar）：取適量的蒸餾水，加入10%過篩烘乾後的壤土及0.8~1%的瓊脂，裝在螺旋蓋試管中，間歇消毒三次，每次消毒後將砂管混合均勻，待冷卻後把要保存的病原菌移入砂管，於室溫下保存。7. 冷凍（freezing）：大部分病原微生物於冰點以下會死亡，但有些置入冰點以下的環境中，數日後再回溫而仍存活，表示可利用冷凍來長期保存。其中最好將病菌置入懸浮介質（suspension substrates）中，再保存於冰凍箱(freezer)中冰凍。通常一種或兩種懸浮介質可通用於大部分微生物，但有些則需要特別者。適於一病原之懸浮介質不一定適用另一病原，即使是同一病原的不同生理小種亦是如此。8. 保存於液態氮（preservation in
liquid nitrogen）：液態氮溫度-196℃ 幾乎生物代謝停止，將微生物置於安瓿瓶內密封存於液態氮為ATCC（ American Type Culture Collection ）
及CMI （ CommonwealthMycological
Institute）標準保存方法，因不易變異及不影響形態及病7-21原性。若以氣態空間保存則可用抗凍的聚丙烯塑膠小瓶，若以液態空間則需玻璃安瓿瓶。安瓿瓶內須添加抗凍劑（cryoprotectivesolution，如10-30%甘油），而直接將裝有抗凍劑與微生物的安瓿瓶丟入液態氮桶內，常會對微生物造成傷害，故序列降溫機可避免冰點期造成的冰晶破壞細胞9. 低壓及真空乾燥（lyophilization and vacuum drying）：冷凍乾燥或真空乾燥法為最常用之方法，幾乎所有細菌、酵母菌及大多數真菌以此法保存之效果良好，其原理是藉由高真空乾燥法，降低孢子水分含量至2~3%，將病原菌保存在無氧及水氣的狀態下。須具備有低壓乾燥設備，步驟大約為：(1)孢子（細菌菌體）懸浮液預凍；(2) 冷凍真空乾燥；(3)室溫真空乾燥；(4)真空封瓶（sealing
of the ampules invacuo）。
常用的培養基與配製法 A. 2%水瓊脂（2% water agar, 2% WA）：取20 g 之洋菜粉（Bacto-agar，Difco）加入 1,000 ml 蒸餾水中，以高壓殺菌釜消毒
20 min（121℃，1.2kg/cm2），倒成平板，靜置於實驗桌上 2-3 天後備用。供病原菌分離用。B. 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar, PDA）：切取去皮之馬鈴薯 200g加 1,000 ml 蒸餾水煮沸 10 min，取其過濾液，加入 20 g 之洋菜粉（Bacto-agar，Difco），再加入 20 g 葡萄糖，並將最後體積調整為 1,000ml，分裝於 500ml 燒杯或每 9 ml 分裝於試管（直徑 1.8 cm、高 17.8 cm）中，經高壓殺菌倒成平板或擺成斜角 30-45度之斜面培養基，靜置於實驗桌上 2-3 天後備用。供菌種保存與病原菌鑑定用。C. 五氯硝苯蛋白凍瓊脂（quintozene peptone agar，PCNB 培養基）：取 1gKH2PO4、0.5g MgSO4‧7H2O 及 20g Difco Bacto-agar 加入 1,000ml 蒸餾水中，高壓殺菌，待其冷卻至 90℃ 時，迅速加入 15 g 之 peptone，並靜置於 55 -60℃ 之 水 浴 槽 中 ， 待 其 溫 度 平 衡 後 ， 加 入 1gpentachloro-nitrobenzene（PCNB），再待其冷卻至 45℃ 時，加入 0.5gstreptomycin 和 0.1g neomycin，混合均勻後，倒成平板，靜置於實驗桌上 2-3 天後備用。供分離鑑定Fusarium spp. 用。D. 含單寧酸之 2%水瓊脂（2% water agar
containing tannic acid）：將消毒過後之
2% 水瓊脂於溶融狀態下，在 45℃ 時，加入單寧酸（tannic acid）300 ppm，混合均勻後，倒成平板。置於陰暗處遮光備用；供分離立枯絲核菌用。E. 營養瓊脂（nutrient agar, NA）：取 Difco Bacto-nutrient agar 23 g 加入 1,000ml 蒸餾水中，高壓殺菌後，供分離病原細菌用。F. 5%經離心V-8蔬菜汁瓊脂（5%clarified V-8 vegetable juice agar，5%CV8）：將50ml V-8蔬菜汁（V-8 vegetable juice，Campell Co.）與2g CaCO3混合後，經5000 rpm 離心 5min，取上層液加蒸餾水至1000 ml，即為5%CV8蔬菜汁，供腐霉菌產生菌絲及孢囊；再加入瓊脂（Bacto-agar，Difco）20 g，則是5%CV8蔬菜汁瓊脂，經高壓殺菌後，倒成平板供腐霉菌培養及鑑定之用。
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