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接種、分離純化和培養技術    一、接種
將微生物接到適於它生長繁殖的人工培養基上或活的生物體內的過程叫做接種。 １、接種工具和方法 在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環、接種針。由於接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養基表面要將菌液均勻塗布時，需要用到塗布棒。常用的接種方法有以下幾種：
１）劃線接種 這是最常用的接種方法。即在固體培養基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。
２）三點接種 在研究黴菌形態時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落後，來觀察、研究它們的形態。除三點外，也有一點或多點進行接種的。
３）穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常採用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養基一般是半固體培養基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺，如某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。
４）澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養皿中，然後再倒入冷卻至45°C 左右的固體培養基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到稀釋的目的。待平板凝固之後，置合適溫度下培養，就可長出單個的微生物菌落。
５）塗布接種 與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然後再將菌液倒入平板上面，迅速用塗布棒在表面作來回左右的塗布，讓菌液均勻分佈，就可長出單個的微生物的菌落。
６）液體接種 從固體培養基中將菌洗下，倒入液體培養基中，或者從液體培養物中，用移液管將菌液接至液體培養基中，或從液體培養物中將菌液移至固體培養基中，都可稱為液體接種。
７）注射接種 該法是用注射的方法將待接的微生物轉接至活的生物體內，如人或其他動物中，常見的疫苗預防接種，就是用注射接種，接入人體，來預防某些疾病。 ８）活體接種
活體接種是專門用於培養病毒或其他病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種於活的生物體內才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料餵養。
２、無菌操作 培養基經高壓滅菌後，用經過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）於培養基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。
實驗臺面不論是什麼材料，一律要求光滑、水準。光滑是便於用消毒劑擦洗；水準是倒瓊脂培養基時利於培養皿內平板的厚度保持一致。在實驗臺上方，空氣流動應緩慢，雜菌應儘量減少，其周圍雜菌也應越少越好。為此，必須清掃室內，關閉實驗室的門窗，並用消毒劑進行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數量。
空氣中的雜菌在氣流小的情況下，隨著灰塵落下，所以接種時，打開培養皿的時間應儘量短。用於接種的器具必須經幹熱或火焰等滅菌。接種環的火焰滅菌方法：通常接種環在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉動一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養基，待接種環冷卻到室溫後，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養基上。（圖３－４）然後，將接種環從柄部至環端逐漸通過火焰滅菌，復原。不要直接燒環，以免殘留在接種環上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培養皿的蓋打開一小部分進行接種。在向培養皿內倒培養基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應傾斜一下在火焰上通過。
二、分離純化 含有一種以上的微生物培養物稱為混和培養物（Mixed
culture）。如果在一個菌落中所有細胞均來自於一個親代細胞，那麼這個菌落稱為純培養（Pure
culture）。在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱為分離純化，方法有許多種。 １、傾注平板法 首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營養瓊脂培養基充分混合，然後把這混合液傾注到無菌的培養皿中，待凝固之後，把這平板倒置在恒箱中培養。單一細胞經過多次增殖後形成一個菌落，取單個菌落製成懸液，重複上述步驟數次，便可得到純培養物。２、塗布平板法
首先把微生物懸液通過適當的稀釋，取一定量的稀釋液放在無菌的已經凝固的營養瓊脂平板上，然後用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地塗布在培養基表面上，經恒溫培養便可以得到單個菌落。
３、平板劃線法 最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環取培養物少許在平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。當接種環在培養基表面上往後移動時，接種環上的菌液逐漸稀釋，最後在所劃的線上分散著單個細胞，經培養，每一個細胞長成一個菌落。
４、富集培養法 富集培養法的方法和原理非常簡單。我們可以創造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。所創造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養基和培養條件下，經過多次重複移種，最後富集的菌株很容易在固體培養基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。通過多次重複移種便可以得到純的寄生菌。５、厭氧法
在實驗室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養基的試管作為培養容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數分鐘，以便逐出培養基中的溶解氧。然後快速冷卻，並進行接種。接種後，加入無菌的石蠟於培養基表面，使培養基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種後，利用N2或CO2取代培養基中的氣體，然後在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種於培養基上，然後再把培養皿放在完全密封的厭氧培養裝置中。
三、培養 微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。微生物的種類不同，培養的方式和條件也不盡相同。１、影響微生物生長的因素
微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多因素的影響。影響微生物生長的因素很多，簡要介紹如下。1) 營養物濃度
細菌的生長率與營養物的濃度有關:μ=μmax*C/(K+C) 營養物濃度與生長率的關係曲線是典型的雙曲線。 K值是細菌生長的很基本的特性常數。它的數值很小，表明細菌所需要的營養濃度非常之低，所以在自然界中，它們到處生長。然而營養太低時，細菌生長就會遇到困難，甚至還會死亡。這是因為除了生長需要能量以外，細菌還需要能量來維持它的生存。這種能量稱為維持能。另一方面，隨著營養物濃度的增加，生長率愈接近最大值。
２）溫度 在一定的溫度範圍內，每種微生物都有自已的生長溫度三基點：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點內，微生物都能生長，但生長速率不一樣。微生物只有處於最適生長溫度時，生長速度才最快，代時最短。超過最低生長溫度，微生物不會生長，溫度太低，甚至會死亡。超過最高生長溫度，微生物也要停止生長，溫度過高。也會死亡。一般情況下，每種微生物的生長溫度三基點是恒定的。但也常受其他環境條件的影響而發生變化。
根據微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個類型： a.嗜冷微生物：其是適生長溫度多數在-10℃ －20℃ 之間 b.中溫微生物：其最適生長溫度一般在20℃ －45℃ 之間 c.嗜熱微生物：生長溫度在45℃ 以上。 ３）水分 水分是微生物進行生長的必要條件。芽孢、孢子萌發，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長發育的水分活性範圍內，均具有狹小的適當的水分活性區域。４）氧氣
按照微生物對氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個類型。 a.需氧微生物 這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大於大氣中氧氣濃度的條件下生長。絕大多數微生物都屬於這個類型。 b.兼性需氧微生物 這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下，都能生長，只不過所進行的代謝途徑不同罷了。在無氧氣存在的條件下，它進行發酵作用，例如酵母菌的無氧乙醇發酵。 c.微量需氧微生物 這類菌是需要氧氣的，但只在0.2大氣壓下生長最好。這可能是由一它們含有在強氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。 d.耐氧微生物 這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會被氧氣所殺死。 c.厭氧微生物 這類微生物在生長過程中，不需要分子氧。分子氧存在對它們生長產生毒害，不是被抑制就是被殺死。 ２、培養方法 1）根據培養時是否需要氧氣，可分為好氧培養和厭氧培養兩大類。 好氧培養：也稱“好氣培養”。就是說這種微生物在培養時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養多數是通過搖床振盪，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。
厭氧培養：也稱“厭氣培養”。這類微生物在培養時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養過程中，最重要的一點就是要除去培養基中的氧氣。一般可採用下列幾種方法： a.降低培養基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養基中，便可達到目的。有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養基中，也可適合厭氧菌的生長。 b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養吸收氧氣；用植物組織如發芽的種子吸收氧氣；用產生氫氣與氧化合的方法除氧。 c.隔絕阻氧：深層液體培養；用石蠟油封存；半固體穿刺培養。 d.替代驅氧
用二氧氣碳驅代氧氣；用氮氣驅代氧氣；用真空驅代氧氣；用氫氣驅代氧氣；用混和氣體驅代氧氣。 ２）根據培養基的物理狀態，可分為固體培養和液體培養兩大類。固質培養：是將菌種接至疏鬆而富有營養的固體培養基中，在合適的條件下進行微生物培養的方法。
液體培養：在實驗中，通過液體培養可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。

博碩士研究論文:

1.中草藥對肝炎之研究探討...實踐大學食品營養所93碩士論文　

2.固態發酵樟芝對小鼠免疫調節及抗腫瘤...南台科技大學生技所93碩士論文

3.樟芝酒製備及功能性評估...南台科技大學生技所93碩士論文

4.利用動物細胞監測發酵培養的樟芝之生物活性...清華大學生物資訊與結構生物所93碩士論文　

5.牛樟芝菌絲體對腫瘤細胞的影響...南台科技大學生技所92碩士論文

6.中草藥發酵產物對抑制腫瘤細胞之功能性評估...南台科技大學生技所92碩士論文

7.利用蛋白質體探討樟芝萃取物處理在人類肺癌細胞株(A549)...南台科技大學生技所92碩士論文

8.不同發酵碳源之牛樟芝菌絲體發酵過濾液對人類肝癌細胞株之影響...台灣大學食科所92碩士論文

9.不同培養時間生產之樟芝發酵液對癌細胞生長之影響...台灣大學食科所92碩士論文

10.樟芝抗腫瘤活性之研究...成功大學藥理所92碩士論文　

11.高產率牛樟芝菌絲體及產物產程的開發...長庚大學生化與生醫工程研究所92碩士論文　

12.樟芝發酵液之抗發炎及其誘導癌細胞凋亡機制之探討...中國醫藥大學營養研究所92碩士論文　

13.牛樟芝不同極性區分保肝機能性之研究...中山醫學大學營養研究所92碩士論文　

14.不同培養方式對樟芝多醣及乙醇抽出物生產之研究...大葉大學生物產業92碩士論文

15.牛樟芝(Antrodia camphorata)液體培養及其成分分析...屏東科技大學熱帶農業所92碩士論文

16,高通量篩選出牛樟芝菌絲體抗肝癌先導藥物化合物...中正大學化學所92碩士論文

17.樟芝深層醱酵液之成分分析...實踐大學食品營養所92碩士論文　

18.針葉樹對樟芝菌絲體生長促進因子及樟芝菌絲體成分研究...台北醫學大學生藥所91碩士論文

19.樟芝深層培養液抗氧化及抗腫瘤特性之研究...中興大學食品科學研究所91博士論文

20.樟芝活性多醣體之生物活性及免疫調節抑制腫瘤之研究...台灣大學生化所91博士論文

21.樟芝中免疫調節蛋白的純化與其生理活性之探討...台灣大學園藝所91碩士論文