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花藥和花粉培養 第一節 花藥和花粉培養技術 第二節 花藥和花粉培養的應用 本章小結 目的要求：(1)掌握花藥培養和花粉培養的區別(2)瞭解花藥最佳接種時期(3)掌握花藥培養的大致過程(4)掌握花粉發育的四種途徑(5)掌握花粉培養的大致過程 第一节 花藥和花粉培養技術 花藥培養是把花粉發育到一定階段的花藥接種到培養基上，來改變花粉的發育程式，使其分裂形成細胞團，進而分化成胚狀體，產後再生植株，或形成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株。 一、培養方法 （一）花粉發育時期 1.適宜的花粉發育時期 選擇合適的花粉發育時期，是提高花粉植株誘導成功率的重要因素。被子植物的花粉發育由孢子四分體分散成單核小孢子開始。 2.花粉發育時期的檢測 壓片染色法是檢測花粉發育時期的簡便有效方法，常用染色劑是醋酸洋紅。 （二）培養過程 1.花藥培養過程 （1）材料預處理 接種前將採集的花蕾或花序以理化方法處理能提高花粉植株誘導頻率。處理方法有低溫、離心、低劑量輻射、化學試劑處理等。 （2）表面消毒 因為未開放的花蕾中的花藥為花被包裹，本身處於無菌狀態，可僅用70％酒精棉球將花的表面擦洗即可。也可按對其他器官消毒處理方法進行，先用70％的酒精浸一下後，在飽和漂白粉溶液中浸10～20min，或用0.1％升汞液消毒7～lOmin，然後用無菌水洗3～5次。將花蕾剪下放入水中，在冰箱4～5℃下保持3～4d。 （3）接種 接種時把花蕾用解剖刀、鑷子小心剝開花蕾，取出花藥，注意去掉花絲，然後散落接種到培養基上，一個l 0m l的試管可接種20個花藥。培養溫度在23～28℃左右，每天11～16h的光照，光照強度2000～4000Lx。脫分化培養時，可用MS + 2,4-D的培養基，或N6+2,4-D的培養基，經10～30d，可誘導生成愈傷組織，或少數生成胚狀體。 （4）培養 一種植物的花藥可以在一種培養基上長幼苗，而在另一種培養基上則形成愈傷組織。如水稻通常在含有生長素的培養基上誘導出愈傷組織，而在不含任何激素的N6培養基上長出胚狀體。但在辣椒的花藥培養中，只要培養基合適，甚至可以在同一花藥上一部分花粉形成胚狀體，而另一部分隻形成愈傷組織。 （5）植株的誘導 誘導愈傷組織分化芽或根，需將其轉入分化培養基和生根培養基 2.花粉培養 花粉培養是指把花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒作為外植體進行離體培養的技術。由於花粉已是單倍體細胞，誘發它經愈傷組織或胚狀體發育成的植株都是單倍體植株。且不受花藥的藥隔、藥壁、花絲等體細胞的干擾。但缺點是較比花粉培養難度大。 （1）花粉的分離 取新鮮未開的花蕾用自來水沖洗10min，用75％的酒精消毒 10～15min，無菌水沖洗2次，再用10％漂白粉上清液浸泡20min，無菌水沖洗3-4次。然後將花藥放到加有基本培養基的小燒杯中，用注射器的內管在燒杯的壁上擠壓花藥，使花粉從花藥中釋放出來。用尼龍篩過濾掉藥壁組濾液再經低速離心(100～160r／min)，上面的碎片可用吸管吸掉，再加入新鮮培養基。連續進行兩次過濾，到每毫升含103～104個花粉的濃度就可以了。簡單的方法是花粉從花藥中擠出後，用鑷子取出花粉空殼，放在培養基上培養。此法適於微室栽培，但往往有藥壁等體細胞混入。 （2）花粉培養的方法 ①看護培養法 在裝有50ml液體培養基的小培養皿中，用解剖針撕開花藥釋放出花粉，形成花粉懸浮液，最後稀釋至0.5ml培養基中，含有10個花粉粒的細胞懸浮液。看護培養時，把花藥放在瓊脂培養基表面上，然後在每個花藥上覆蓋一小塊圓片濾紙。用移液管吸取l滴已準備好的花粉粒懸浮液，滴在每個小圓片濾紙上。培養在25℃和一定光照強度下，大約一個月長出細胞群。由於完整的花藥發育過程釋放出有利於花粉發育的物質，並通過濾紙供給花粉，促進了花粉的發育。培養的花粉形成胚有兩個途徑：一是花粉核分裂產生營養核和生殖核，以後生殖核退化，營養核則繼續分裂2～3周，形成多核花粉，由此形成多核的原胚；二是花粉核直接分裂，再形成胚。 ②溫室培養法 取含有50～80粒花粉的一滴培養液放在溫室培養裝置中，為了防止花粉破裂，應在低溫條件下( 4℃以下)接種，然後在20℃下培養。 二、培養基 （一）基本培養基 花藥培養所採用的培養基是MS、N6、B5等。 （二）植物生長的種類和濃度 添加的激素有6-BA、KT和玉米素，2,4-D，NAA和IAA等。誘導愈傷組織的培養基可添加2，4-D，其濃度為1～3mg／L，分化培養基可添加2～3mg／L的BA，再加少許的IAA(0.2～0.5mg／L)，生根培養基可單獨添加生長素(0.5～lmg／L)。 （三）蔗糖濃度 基本培養基中的蔗糖濃度對花粉的誘導生長有一定作用。在辣椒花藥培養中以6％的蔗糖濃度對胚狀體的誘導率為最高。在番茄花藥培養中需要量高達14％。其原因是花粉母細胞的滲透壓比花絲等體細胞高的緣故，即高濃度的蔗糖不利於藥壁、花絲等體細胞的生長，而利於花粉的生長。 （四）有機附加物 三、單倍體植株的染色體加倍 （一）花粉植株的倍性 由花藥培養產生的花粉植物不僅有單倍體，還有二倍體、三倍體及非整倍體 （二）單倍體植株染色體加倍的方法 單倍體植株營養體瘦小，只含一套染色體而不能進行正常減數分裂，不能開花結實，需經加倍處理使之成為純和二倍體。 1.自然加倍 通過花粉細胞核有絲分裂或核融合染色體可自然加倍，從而獲得一定數量的純和二倍體，其優點是不會出現畸形，不足之處是隨機性強，難以掌握和利用。 2.人工加倍 人工加倍指用秋水仙素處理單倍體植物，使染色體加倍的方法 3.從愈傷組織再生 將單倍體植物（孢子體）的莖段、葉柄、根莖切下，置適宜的培養基上使之發生愈傷組織，反復繼代後再將愈傷組織轉移到分化培養基上，即可獲得較多二倍體植株 第二節 花藥和花粉培養的應用 一、單倍體植物在育種中的作用 1.克服後代分離，縮短育種年限 常規育種中，雜交後代自第二代（F2）起開始出現分離，多樣化的性狀分離要持續到F6代後才能穩定。 2.選擇效率高 3.有利於隱性基因控制性狀的選擇 雜交育種中常因等位基因中隱性基因被顯性基因掩蓋，而使隱性基因控制的性狀不表現，要連續種植數代，直至隱性基因純和才出現該基因的性狀。 4.快速獲得自交系的超雄株 通常採用連續人工自交方法，獲得一個自交系至少需6年 二、我國單倍體育種的成就 1.水稻 2.小麥 3.玉米 本章小結 (1)花藥培養是器官培養，花粉培養屬細胞培養，但二者培養目的是一樣，都是要誘導花粉細胞發育成單倍體細胞，最後發育成單倍體植株。 (2)花藥培養一般選擇花粉的單核期進行接種，因為這一時期尚沒有澱粉的積累。 (3)花藥培養包括：選擇材料-消毒-接種培養-癒合組織生成-分化出單倍體植株。 (4)花粉的發育途徑包括：營養細胞發育、生殖細胞發育、營養和生殖細胞同時發育及花粉均等分裂發育途徑。 (5)花粉培養包括花粉的分離-預處理-培養過程。 ...............TTC Loomayorchids
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