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生物技術在幾種植物生物活性物質生產中的最新應用
植物不僅為人類的生存和發展提供了必要的食物，其次生代謝產生的天然成分已被人類廣泛應用於藥品、食品添加劑、風味物質、香料、色素、化妝品、生物殺蟲劑和農用化學品。在已知的3萬多種天然產物中，80%來源於植物[1]。儘管其中的植物生物活性物質並不是很多，但它們與人類健康密切相關，已成為當前生物領域研究關注的重點。它們分屬於糖類、生物鹼、類黃酮、甾醇、萜類、皂苷、多酚類、有機酸以及維生素、色素類等。許多含有這些生物活性物質在植物被成功開發成中草藥。但這些成分在藥用植物中的含量很少，且有的藥用植物栽培困難很多，一時尚難實現大規模人工栽培，如人參、雪蓮、杜仲、黃連；有的容易感染病毒造成品質退化如太子參、地黃等；還有的如肉蓯蓉、麻黃、番紅花等按常規育苗週期長，植株繁殖係數小、再生能力低。
生物技術的應用解決了上述問題，使植物生物活性物質的大規模生產成為可能。以細胞工程、基因工程、發酵工程、酶工程為主體的現代生物技術特別是細胞工程技術在植物生物活性物質生產中的應用日益廣泛和深入。迄今為止，全世界已有1 000多種植物被用作組織和細胞培養的材料，半數以上的培養物中生物活性物質含量超過野生狀態的含量。已處於中試階段的植物有：紅豆杉細胞培養生產紫杉醇、紫草細胞培養生產萘醌類化合物；長春花細胞培養生產生物鹼、苦瓜培養生產類胰島素、三七細胞培養生產皂苷和丹參細胞培養生產丹參酮。已實現工業化生產的有：日本黃連生產黃連堿、人參細胞培養生產人參皂苷、紫草細胞生產紫草寧等。此外，從天山雪蓮細胞培養分離出總黃酮；從冬蟲夏草深層發酵液中分離出蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸等30多種化合物；從千層塔培養物中分離出石杉堿、雷公藤培養物中提取到雷公藤甲素；懷槐細胞培養分離得具有保肝作用的異黃酮；石斛細胞懸浮培養出具有抗腫瘤、增強機體免疫力功效的石斛多糖等[2]。本文介紹細胞工程為主的生物技術在幾種植物生物活性物質生產上的應用，如紫杉醇、懷槐異黃酮、石斛多糖等，包括化學因素（培養基）、物理因素（溫度、光照）以及生物因素、誘導子添加、前體化合物的加入對生物活性物質產生的影響。同時，對生物活性物質的應用前景作了探討，為該領域的進一步研究提供參考。
1 紫杉醇 紫杉醇是從紅豆杉科紅豆杉屬 (Taxus sp.)植物樹皮、枝葉等部位中分離出的二萜類化合物, 對卵巢癌、子宮癌、乳腺癌等10多種癌症具有很好的療效, 被譽為20世紀90年代抗腫瘤藥三大成就之一。我國有紅豆杉Taxus chinensis (Pilger) Rehd.、東北紅豆杉T.
cuspidata Sieb. et Zucc.、南方紅豆杉T.chinensis var. mairei、西藏紅豆杉T. wallichiana Zucc.、雲南紅豆杉T. yunnanensis
Cheng et L. K. Fu等幾種[3]。自然生長的紅豆杉生長緩慢，紅豆杉樹紫杉醇含量又很低（不到萬分之一），無法滿足需求。目前，國內紫杉醇原料需求量為1 500 kg ，年產量卻不足100 kg ；全球紫杉醇需求量為5 000 kg ，年產量不超過500 kg 。採用細胞培養的方法是解決供需矛盾的有效途徑之一。以東北紅豆杉T.cuspidata和曼地亞紅豆杉T.media（東北紅豆杉與歐洲紅豆杉T. baccdfa的雜交品種）為材料，對不同接種量、培養基種類、蔗糖品質濃度時懸浮細胞體系中紫杉醇的生產量的比較研究結果表明,東北紅豆杉細胞懸浮培養適宜的接種量是2g/瓶、培養基為B5基本培養基、蔗糖品質濃度20～30 g/L時懸浮培養細胞的生長較好。東北紅豆杉懸浮細胞在B5培養基中品質濃度為0.127 mg/L,曼地亞紅豆杉懸浮細胞在B5培養基中品質濃度為0.487 mg/L。東北紅豆杉培養於改良的GB5培養基(添加0.5mg/L的NAA)上培養，產生10個已知的taxoids化合物，有紫杉醇、7-表紫杉醇、紫杉醇C、漿果赤黴素VI（baccatin VI）等[4]。南方紅豆杉莖段愈傷組織在不同基本培養基及激素組合的培養基上，其平均鮮重生物量具顯著差異，而幹重生物量無差異。TA或B5基本培養基附加1.0 mg／L NAA和0.5 mg／L BA為其愈傷組織生長的適宜配方[5]。對南方紅豆杉用75種激素處理的實驗中證實NAA 1m g／L+6-BA 1m g／L的處理可獲得最大增長率達2.517[6]。對南方紅豆杉細胞紫杉醇代謝動力學研究表明：在細胞生長的對數期繼代較靜止期繼代的細胞增長率提高1.6倍，同時紫杉醇含量提高了近4倍；對數期繼代的細胞吸收碳源、氮源早於靜止期細胞，而2個處理的細胞對磷酸根和銨根的吸收則無明顯差異。對數期繼代有利於細胞生物量的增殖和紫杉醇的含量的提高。此外，紅豆杉細胞次生代謝的研究中發現中間產物baeⅢ大量積累，約為紫杉醇含量的3倍[6]。近年來針對真菌誘導子對藥用植物細胞培養產生的生物活性物質的影響做過不少研究。 在紅豆杉細胞培養第20 d時，加入桔青黴紫杉醇誘導子處理5 d及10 d後，細胞中可溶性蛋白質含量增加，苯丙氨酸解氨酶活性增強，培養基pH值降低，細胞可溶性蛋白質、過氧化物酶與酯酶同工酶電泳掃描圖譜中出現新的譜帶，原有個別譜帶強度發生變化[7]。除了上述以紅豆杉為原料生產紫杉醇以外，還分離出2株產紫杉醇內生真菌T14 和Y3，對其發酵條件的優化研究結果表明，相同條件下，T14產紫杉醇的含量明顯高於Y3產紫杉醇的含量；T14產紫杉醇的最適溫度為30 ℃ ，最佳pH為5.5，最適碳源為蔗糖，最適氮源為0.3%的氯化銨；間歇補加蔗糖有助於菌體的快速生長紫杉醇的積累；在培養基中添加前體苯丙氨酸對紫杉醇含量的提高有明顯促進作用，添加由苯丙氨酸、乙酸銨和酪氨酸組成的混合前體則作用更為明顯，紫杉醇產量達到352.64 μg/L。另外，培養基中添加Mg2SO4、MnCl2、KH2PO4等微量元素，卻完全抑制了紫杉醇的產生[8]。
2 肉蓯蓉苯乙醇苷肉蓯蓉為列當科多年生寄生草本植物, 我國有4種1變種，分別為荒漠肉蓯蓉Cistanche deserticola Y.C.M、鹽生肉蓯蓉C.salsa (C.A.M ey.) Benth.et Hook.f.、管花肉蓯蓉C.tubu
losa (Schenk) R. Wight、沙蓯蓉C.sinensis G.B eck和白花鹽蓯蓉C. sala (C. A. Mey.) G. Beck. var. albiflora P. F. Tuet Z. C. Lou, 生於我國新疆、內蒙古、陝西、甘肅和寧夏等地區的鹽鹼地、幹河溝或戈壁灘上。肉蓯蓉在滋補配方中僅次於人參居第二位,享有“沙漠人參”的美譽。其主要活性成分為苯乙醇苷(Phenylethanoid glycosides, PeGs)，具有抗癌和抗衰老作用[9]。李娟以野生荒漠肉蓯蓉的肉質莖為外植體, 經過愈傷組織誘導篩選、建立了穩定的肉蓯蓉細胞株系[10]。愈傷組織培養基配方為B5+CH( 500m g/L)+IAA( 2 m g/L)+BA( 1
m g/L), 生長週期為25 d,幹重達到13.2 g/L,其苯乙醇甙含量達到幹重的12.9%。並繼而建立了肉蓯蓉細胞懸浮培養體系, 培養基配方為MS+GA3 ( 10 m g/L)+BA( 0.5 m g/L) +CH( 800 m g/L),生長週期為36d,生長曲線呈“S”型。幹重達到15.4 g/L,其苯乙醇甙含量達到幹重的2.4%,與野生中含量幾乎相等[11]。研究發現有2種生物誘導子殼聚糖、寡聚糖和3種非生物誘導子茉莉酸甲酯、水楊酸和膨潤土能誘導肉蓯蓉懸浮培養細胞苯乙醇甙的生物合成[11-12]。肉蓯蓉培養細胞生長與苯乙醇苷的生成及培養基質利用動態變化關係研究表明，細胞內苯乙醇糖甙(PeG)的比生成速率YP/X與肉蓯蓉細胞比生長速率μ大致成線性關係。在培養過程中, 培養基中的磷酸鹽和氨鹽被迅速消耗, 而硝酸鹽的利用稍慢, 基於蔗糖、氨鹽和硝酸鹽的細胞收率係數分別為0.481、60和6.4 g/g,基於蔗糖的PeG收率係數為0.055 g/g[13].基於肉蓯蓉的保健特點，已採用沒有激素的培養基懸浮培養肉蓯蓉細胞，開發出肉蓯蓉系列功能飲料。培養時通過前體苯丙氨酸、酪氨酸飼喂來促進苯乙醇的生物合成，細胞幹重、苯乙醇苷、總黃酮和多糖的產量分別達18.5g/L、3.64、0.75和4.2g/L
Dw, 均比添加外源激素懸浮培養的肉蓯蓉細胞(HC)合成產量高[13]。國內目前已有2家單位完成了肉蓯蓉苯乙醇苷大規模生物反應器工廠化生產工藝和苯乙醇苷的分離提純研究，取得國家級科技成果，並申請了2項發明專利。把苯乙醇苷類化合物的含量提高到幹細胞重的10%～20%[14-15]。
3 懷槐異黃酮 懷槐Maackia amurensis Rupr. et Maxim.是我國珍貴的野生藥用植物，為豆科馬鞍樹屬落葉小喬木,《本草綱目》記載, 具有祛風濕、消炎、鎮痛、健胃、止血等功效, 民間用於治療肝臟疾病和膽囊炎, 其藥用成分異黃酮（主要為芒柄花黃素、染料木素、大豆甙元等）具有顯著的保肝、抗腫瘤、抗氧化及防治骨質疏鬆等藥理活性[16]。在10 L 氣升式生物反應器中進行了懷槐細胞懸浮試驗。獲得的最佳培養基組合是149.68 mg/L (NH)2SO4、2 936.10 m g/L KNO3、0.01 mg/L
2,4-D和0.19 mg/L 6-BA, 染料木素產率達到14.13 mg/L, 比優化前提高18.09倍, 是正交試驗優化的2.54倍[16]。也有研究認為適合異黃酮積累的最佳濃度組合為1 500 m g/L KNO3、200 mg/L (NH4)2SO4和0.1 mg/L BA,細胞中異黃酮積累平均達到了19.3 mg/L,比優化前提高了9.3倍[17]。硝酸鈰、硝酸鑭等稀土元素化合物, 是懷槐培養細胞異黃酮合成的有效誘導子。水楊酸(SA)也是其有效誘導子，其最佳濃度為100 μmol／L[18]。茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）和一氧化氮（NO）3種激發子對懷槐懸浮培養物異黃酮合成及細胞結構變化的影響研究表明，這些物質可使異黃酮合成量比對照提高317．18％、85、45％和122．45％[16]。
4 石斛多糖 石斛多糖具有延緩衰老、增強免疫力、抗腫瘤、降血糖等多種藥理活性。2005年版《中國藥典》收載了金釵石斛、鐵皮石斛和馬鞭石斛3種。鐵皮石斛Dendrobium candidum Wall．ex Lindl 為蘭科石斛屬多年生草本植物，是我國傳統的名貴中藥材，是石斛中的極品。具有益胃生津、滋陰清熱、潤肺止咳的功效。近年來，由於過度消耗，石斛野生資源已瀕臨絕跡。培養鐵皮石斛原球莖是解決藥源不足的重要途徑。液體培養在生物量、多糖產量等方面均優於固體培養，表現在：原球莖在液體懸浮培養條件下，幹重量在50 d達到最大為17.64 g ／L，多糖產量在40 d達到最大值為3 081.2 mg／L，在固體培養條件下，培養60 d幹重達到最大為13.40 g ／L，多糖產量在40 d達到最大值為2
412.5 mg／L，分別比液體懸浮培養少4.24 g ／L、568.7 mg／L；從形態上看，固體培養的原球莖較綠，芽分化明顯，胚狀體弱小，液體懸浮培養的原球莖以黃色為主，稍有綠色，芽分化不明顯，胚狀體均勻、粗壯。表明通過液體懸浮培養生產鐵皮石斛原球莖具有較好的開發應用前景[19]。對鐵皮石斛原球莖與小菇屬真菌MF24(Mycena sp.)誘導子的相互作用進行了系統研究，獲得了真菌誘導子在鐵皮石斛原球莖培養中的最佳工藝[20]。昆明高新五華科技園2005年開展稀藥用植物鐵皮石斛細胞培養物中多糖研究專案，每月製作和接種培養基可達8 000 L ，可生產鐵皮石斛細胞400 kg 。並開展鐵皮石斛細胞培養物中多糖分離、萃取及產業化研究[21]。另外，對霍山石斛Dendrobium huoshanenses G.Z.Tang et S.J.Cheng原球莖進行了生物反應器懸浮培養研究[22-23]。
5 劍麻蛋白酶 植物蛋白酶在食品、輕工、醫藥等行業中，蛋白水解酶以其對蛋白質高效專一的分解特性而廣泛應用於肉類嫩化、啤酒澄清、乾酪製造、海產品加工、蛋白質水解、加酶洗滌劑的製造和化妝品等方面, 還可用於治療某些炎症和消化不良等疾病[24]。劍麻蛋白酶是蛋白酶的新資源。劍麻組織和細胞培養基類型、培養條件、培養基組成對愈傷組織細胞生長和蛋白酶活力的影響研究結果：（1）劍麻愈傷組織的誘導與培養 在MS、LS、N6、B5 4種培養基中，N6培養基誘導劍麻愈傷組織啟動最快；LS、MS培養基劍麻愈傷組織誘導率高、繼代培養生長效果好；B5培養基不適於在劍麻組織和細胞培養中採用。(25±2)℃培養溫度下劍麻愈傷組織生長快，長勢旺。12 h弱光照和12 h強光照條件下的劍麻愈傷組織啟動快，生長好，24 h光照和黑暗處理不利於劍麻愈傷組織的誘導和生長。
（2）劍麻愈傷組織誘導產蛋白酶。 通過MS、LS、N6、B5 4種培養基進行劍麻愈傷組織誘導產蛋白酶研究，無論進行固體靜態培養，還是液體懸浮培養，4種培養基上生長的愈傷組織均能產生一定量的蛋白酶，但以MS和LS培養基上培養的劍麻愈傷組織產酶活力高[25]。懸浮培養誘導蛋白酶的研究結果：懸浮培養細胞的生長量成倍地高於固體培養細胞;LS、MS培養基是劍麻細胞懸浮培養及誘導產蛋白酶最適的培養基;懸浮培養液中的蛋白酶活力占細胞蛋白酶活力的20.0％～46.9％;懸浮培養細胞生長速率與培養液的pH值存在一定的相關性[26]。
6 其他植物活性物質 近年來利用生物技術生產生物活性物質的研究還有：1. 利用高山紅景天Rhodiola sachalinensis A.Bor懸浮培養生產紅景天甙[27]。2. 靈芝菌絲體多糖發酵產生多糖[28]、金耳Tremella aurantialba Bandoni et Zang菌絲體培養，提取多糖[29]、液體發酵蟲草Cordyceps sinensis菌絲體, 提取菌絲體多糖[30]。3. 銀杏懸浮培養細胞產生銀杏內酯[31]。4. 太子參細胞懸浮培養生產皂苷[32]。5. 懸浮培養雷公藤細胞生產總生物鹼[33]。6. 紫蘇Perilla
frutescens (Linn．）Britt細胞懸浮培養形成花色素[34]、用懸浮培養的玫瑰茄Hibiscus sadariffa Linn合成花青素[35]、穗冠花Celosia cristata (phumosa)愈傷組織培養積累花色素苷[36]、馬藍Strobilanthes cusia（Nees）Ktze細胞懸浮培養提取靛藍、靛玉紅[37]。7. 莪術Rhizoma
Curcumae細胞懸浮培養分離揮發油、多糖等[38]。總之，目前生物技術在植物生物活性物質的研究和應用越來越深入，對保護稀有瀕危藥用植物、實現有效成分的標準化生產有重要意義。隨著研究的不斷深入，21世紀的生物技術在醫藥、食品、化妝品等方面的應用領域還將不斷拓寬，必將在保護人類健康、促進經濟發展發揮重大作用。
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