利用蛋白質體探討樟芝萃取物處理在人類肺癌細胞株(A549).
樟芝又稱牛樟芝或牛樟菇，學名為Antrodia
camphorata，是台灣特有一種真菌，僅生長於台灣特有之牛樟樹，生長緩慢、得之不易，故更顯其彌足珍貴。樟芝在台灣傳統醫藥歷史中始終被視為珍貴藥材，具有神奇的醫療保健功效。根據最近研究顯示，以2 % (v/v) 固態發酵樟芝乙醇萃取液處理人類肺癌A549細胞株72 小時，對A549細胞具有抑殺的效果。在本實驗中，使用蛋白質體學技術來研究經固態發酵樟芝乙醇萃取液處理8小時的A549細胞和未經處理的A549細胞中表現量不同的蛋白質，利用PDQUEST軟體比對經處理及未經處理A549細胞的二維電泳圖譜，以找出表現差異2倍或2倍以上的蛋白質，在本論文中我們找到5個顯示統計上2倍或2倍以上顯著表現差異的蛋白質點（P<0.05）。利用電灑遊離式串連質譜儀鑑定這些表現差異蛋白質點，這五個蛋白質點分別被鑑定為 human galectin-1、human eukaryotic
translation initiation factor 5A
(eIf -5A )、Rho
GDP dissociation inhibitor (Rho-GDI)、human
calcium-dependent protease (CANP) and annexin V. 本論文在經固態發酵樟芝乙醇萃取液處理的A549細胞中找到五個表現差異的蛋白質，這些表現差異的蛋白質可以來幫助推測固態發酵樟芝乙醇萃取液如何影響腫瘤細胞的基因表達，以利未來進一步研究樟芝抑癌的機制。
中草藥發酵產物對抑制腫瘤細胞之功能性評估
樟芝（Antrodia camphorata），又名牛樟菇，屬台灣特有種，在民間為保肝、護肝及抗疲勞之聖品，相關研究證實樟芝具有抑制肝炎病毒活性、緩解身心疲憊及抑制癌細胞生長等。過去的研究大多探討樟芝液態發酵菌絲體的功效，而樟芝的固態發酵鮮少人研究，本研究主要利用藥用真菌－樟芝，搭配數種中草藥（決明子、板藍根、魚腥草、白花蛇舌草、三七）進行共同發酵，經液態及固態樟芝發酵物之乙醇萃取後，利用HPLC分析其成分，並與中草藥萃取液及單純樟芝萃取液比較，以檢視中草藥加入樟芝經發酵後其成份是否會產生變化，發現添加中草藥共同發酵後，僅有固態可產生較多之化合物，液態發酵及外加中草藥萃取物則無此現象。接著並觀察不同濃度（2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml）的發酵產物萃取物，對腫瘤細胞株成長之影響。結果發現中草藥經樟芝發酵後，固態發酵產物較液態發酵產物其代謝成分抑殺腫瘤細胞的能力為佳，並比原中草藥材或單純樟芝發酵物更強，而不同中草藥樟芝固態發酵物對不同的癌細胞有著不同的抑殺效果，這結果顯示中草藥經樟芝細胞代謝後，的確可產生具有腫瘤細胞毒性的化學物質，未來將進行有效成分分離與純化研究，以期能找出新的具抗癌活性的化合物。
樟芝酒製備及功能性評估
在中醫藥的典籍裡明確記載著部份真菌(菇蕈類)的子實體或菌絲體可以應用於食品及醫療保健上。樟芝（Antrodia
camphorata）目前在學界、醫界越來越受注意，很多研究單位極力研發其保肝及抗癌方面的相關產品。另外國內外酒類的市場十分龐大，且國內民間盛行自釀藥酒方面也是多不勝數，如靈芝酒、靈芝啤酒均已上市。我們期望結合樟芝的功效與酒類的普及性，開發出新一代的保健飲品「樟芝酒」。本實驗為利用PDB和MY兩種培養基的樟芝液態菌絲發酵液，以酵母菌進行樟芝酒的釀造，將釀造好的兩類樟芝酒進行分析－包含酒精濃度、甲醇含量、抗氧化能力、對腫瘤細胞株以及正常細胞株影響並更進一步的餵食老齡老鼠主要探討對其免疫能力的影響。研究顯示，各項功能性試驗結果MY樟芝酒皆較PDB樟芝酒為佳，MY樟芝酒顏色為澄清紅褐色，有濃鬱的水果香氣，酒精濃度為11.2%(V/V)，甲醇含量為2.7ppm(以純乙醇計算)。 抗氧化能力，還原力方面，10%MY樟芝酒甲醇稀釋液的還原力相當於0.0168mg/ml的抗壞血酸；捕捉DPPH能力方面，8%MY樟芝酒甲醇稀釋液的捕捉DPPH能力相當於0.0131mg/ml的抗壞血酸。對於腫瘤細胞株影響，MY樟芝酒在濃度為10%時對人類肝癌細胞株(Hep 3B)有65%的抑殺率。在對正常細胞株的影響，MY樟芝酒在實驗濃度內對人類纖維母細胞株(LL4)及老鼠巨噬細胞株(RAW 264.7)沒有影響。對老齡老鼠免疫能力的影響，經六週的餵食，老鼠脾臟經Con A刺激後其增生率分別為控制組28.65%、MY樟芝酒低劑量組32.19%、MY樟芝酒高劑量組126.25%、而脾臟內B cell和T
cell的總合佔全部淋巴細胞的比率為控制組58.4%、MY樟芝酒低劑量組62.4%以及MY樟芝酒高劑量組65.9%。
牛樟芝菌絲體對腫瘤細胞的影響
牛樟芝(Antrodia
camphorata)，僅生長在台灣特有的牛樟樹上，因數量稀少且久為民間所流傳之良好民俗偏方，成為台灣市場上昂貴的野生真菌。本論文之研究目的為樟芝菌絲體在體外模式中對HT-1080細胞株所分泌之金屬蛋白
之影響進行探討。以牛樟芝的水萃液當樣品進行研究，將HT-1080、MDA-MB-231、DU
145以及MCF-7等細胞，藉由MTT試驗、Gelatin zymography analysis及西方墨點法進行分析，檢視其對MMP-2與MMP-9蛋白質的影響，並用MMP-2與MMP-9的抗體做進一步的確認，另外，本實驗也以RT-PCR的方式進行樟芝菌絲體對MMP-2與MMP-9 mRNA 的表現之影響，並利用Transwell進行In Vitro Invasion Assay。由實驗顯示樟芝萃取液對腫瘤細胞(HT-1080、MDA-MB-231、DU 145以及MCF-7)的抑制率分別為80%、74%、69%以及70%，此外在zymography analysis、抗體試驗及西方墨點法得到的結果可知，對HT-1080細胞之MMP-2與MMP-9分泌量有抑制效果，且在RT-PCR試驗中，初步結果有抑制MMP-2與MMP-9 mRNA 的表現，利用Transwell進行In Vitro Invasion Assay證明樟芝樣品可使癌細胞侵襲能力減少。由結果證實樟芝萃取液對抑制腫瘤細胞是有效的，相同的對於HT-1080細胞之MMP-2與MMP-9分泌是有抑制的，且對腫瘤細胞的轉移也有抑制，因此很值得我們進一步研究。
固態發酵樟芝對小鼠免疫調節及抗腫瘤活性之影響
樟芝 (Antrodia camphorata, AC) 為台灣特有藥用真菌。本試驗使用薇得生技公司所生產的固態發酵樟芝 (solid fermentation A.
camphorata, SAC)來檢測其是否具有調節小鼠免疫作用及抗腫瘤之活性。每天餵食不同劑量50、100、200 mg/Kg SAC，並以生理食鹽水為對照組。結果顯示第4 天後餵食SAC 小鼠脾臟細胞數目皆較對照組有顯著增加；在餵食後的第11 天，除餵食200mg/Kg 者之脾臟細胞數目較高外，其他三組無顯著差異。上述增加之脾臟細胞數目以T 細胞為主，但是B 胞在整個餵食過程中則無明顯增加。取出之小鼠脾臟淋巴細胞在非特異性抗原Con A 的刺激下，刺激指數處理組較對照組有顯著增加。注射5-flurouracil (5-FU) 之後同時餵食50 mg/Kg SAC 及生理食鹽水與正常小鼠之試驗結果顯示：5-FU 處理之小鼠，於第4、7 天其脾臟細胞數量明顯低於正常小鼠，而餵食生理食鹽水之小鼠脾臟細胞明顯低於餵食SAC 之小鼠；在第15 天餵食生理食鹽水的小鼠，其脾臟細胞數量大量增生且明顯高於正常小鼠與餵食SAC 之小鼠者，而餵食SAC 之小鼠脾臟細胞數量與正常小鼠沒有顯著異。由以上結果推論SAC 似乎有保護脾臟細胞之現象。以上所述增加之脾臟細胞仍以T 細胞為主，且注射5-FU 並餵食50 mg/Kg SAC 小鼠之CD4+及CD8+ T細胞比例高於正常及餵食生理食鹽水的老鼠，不過B 細胞則無明顯改變。在抗腫瘤的活性測試，體外試驗結果顯示：Hep 3B、A549 及 LL/2 細胞之存活率隨著固態發酵樟芝乙醇萃取液處理濃度及時間之增加而降低。在動物體試驗，固態發酵樟芝能顯著降低老鼠身上的腫瘤大小且延長存活的時間。綜合以上的結果顯示，固態發酵樟芝具有調節小鼠免疫系統及抗腫瘤的效果。
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