中研院覽號：09T-910419
創作人：張唯勤、陳婷玉、陳健忠 本院覽號：09T-910419
葉片繁殖拖鞋蘭--技轉!!!拖鞋蘭(slipper orchids, Paphiopedilum)每株價位仍居千元或萬元不等，迄今仍無有效的無性繁殖法為高居不下之主要原因，談不上量產企業。我們已開發出用成株葉片切塊在合適培養基中，產生多量芽體，分別可發育成植株。珍貴稀有的蘭花品種往往一株就有上百萬元的身價，對一般人來說，的確是「只可遠觀，不可褻玩」。台灣以往被稱為「蘭花王國」，例如馳名國際的蝴蝶蘭、外銷日本的文心蘭以及拖鞋蘭等，為台灣賺進大把的鈔票和國際知名度，但是，現在運用生物技術，只要想辦法取得名貴蘭花的一小片葉子，便可以複製出一顆一模一樣的蘭花了。台灣蘭花花名遠播中研院植物所張唯勤博士花了5年的時間，利用生物技術開發出可以複製文心蘭和拖鞋蘭等高價位蘭花品種的技術。原來一株體態優美、花色艷麗的蘭花品種動輒上千、上萬元，未來或許只要幾十元就買得到了。蘭花是植物界最大的科之一，共有2500多個品系。從熱帶雨林到沙漠地區，都有蘭花分布的蹤跡。搖曳生姿的風采、變化多端的花形以及五彩繽紛的顏色，正是蘭花吸引眾人目光的地方。台灣地處亞熱帶，溫度、氣候、雨量都相當適合蘭花生長，目前已經有多種蘭花進行商業栽培，蝴蝶蘭、文心蘭和拖鞋蘭等，都是國際花卉市場上名聞遐邇的蘭花品種。 這些蘭花的身價不斐，從幾千元一株到上萬元，甚至上百萬元的品種都有，經營花卉進出口貿易的許明哲就指出，蘭花的許多品系，至今仍無有效的無性繁殖技術，再加上蘭花栽培的時間長、種子發芽率又低，因此，價格一直高居不下，近年來，雖有新的繁殖技術出現，但仍無法做到量產的規模。首位嘗試將組織培養的技術應用在蘭花上的法國人莫瑞爾（G. M. Morel），他的方式是取莖頂組織進行培養，再經由類原球體獲得植株。若要以組織培養的方式來繁殖植物，首先就必須取得培植體，也就是從植物上取得細胞、組織或器官，再將這些培植體放入人工培養基上，經過一段時間的培養後，再藉由傷口誘生癒傷組織。葉片組織細胞再生植株雖然目前業界已利用組織培養方法繁殖文心蘭，但仍缺少細胞再生成植株的明確方法。張唯勤則以葉片細胞直接再生成植株，以及由葉片組織所產生的癒傷組織細胞再生成植株等方法，來複製文心蘭。張唯勤表示，以細胞複製文心蘭時，須以花梗、根、莖及葉做為培植體，將這些培植體放入合適的人工培養基，一、兩個月後，癒傷組織便會從根尖、莖及葉培植體的切口部位長出。這些被誘導的癒傷組織可以培養在培養基中，形成更多的癒傷組織，且仍具有再生植株的能力。如此一來，我們便不需要每次都從培植體去誘導新的癒傷組織。獲得大量癒傷組織後，再進行體胚的誘導。理論上，每個細胞都可以產生一個體胚，所以一小塊癒傷組織便可以誘導出數十個；甚至數百個體胚。至於體胚的發生，是培養的體細胞經過一連串類似有性胚發育的過程後，而形成小植株。張唯勤指出，除了以細胞複製文心蘭外，素心蘭、蝴蝶蘭及拖鞋蘭等，都可以經由癒傷組織誘導出小植株，但未來仍需進一步以營養器官或組織來誘導癒傷組織，才能針對特定的品種進行繁殖。直接體胚發生複製文心蘭此外，張唯勤也以直接體胚發生的方式複製文心蘭，這種技術不需經由癒傷組織，便可以誘導培植體形成體胚發生，進而再生植株。他將文心蘭的葉片取下做為培植體，培養在不含植物生長調節劑的培養基中，約一個月後，葉片的尖端、上表面及切口部位，便會形成體胚，經過幾個星期後，體胚會發育成為原球體，然後抽芽長大，最後形成小植株。研究助理陳婷玉表示，以電子顯微鏡觀察體胚，可以看到大量的體胚從葉表面長出，同時除了葉子表面之外，葉子的尖端也是一個較容易形成體胚的地方。她指出，以直接體胚發生來繁殖文心蘭的速率較快，從誘導培植體形成體胚到小植株、出瓶、馴化，僅需五到六個月左右的時間。此外，經由直接體胚發生所獲得的小植株變異的機率較低，因為癒傷組織經過長期的繼代，在生長調節劑等環境的刺激下，容易導致體細胞變異，比較起來，以葉細胞直接形成體胚確實比較穩定。在合適的條件下，每個葉細胞都會形成體胚，一片葉子便可以複製出許多性狀及遺傳物質相同的小植株，而這些小植株的葉片，也可以再用來誘導體胚發生，繁殖效率便可以大大提升。由於沒有一種方式、或培養基，可以適用於複製所有的蘭花品種，因此進行蘭花繁殖時，都必須使用不同的方式。葉片切塊繁殖拖鞋蘭在複製拖鞋蘭的方法上，張唯勤進一步開發一套僅以葉片就可以繁殖拖鞋蘭的技術，也就是用成株的葉片切塊，放到適合的培養基中，以產生多量的芽體，然後，分別發育成植株。這種經特殊設計的培養基，是一種類似植物荷爾蒙的物質，包含Auxin（生長素）Cytokinin（細胞分裂素）等多種成分，可以引導植物誘變，促使植物產生變化。簡單地說，就是以植物荷爾蒙刺激，讓植物產生各種生理變化，例如抽芽、細胞增殖、分裂，決定成長的速度等。一般來說，若採用傳統的栽培方式，拖鞋蘭從第一代到繼代的出現，少說也要等上五年的時間；若以葉片的無性繁殖法，從葉子切片到長出叢生芽，再到成體，只需十個月左右的時間，不但縮短栽培的時間，還可以取得大量且性狀與母代一致的植株。以往拖鞋蘭的原生種一株高達50萬元，現在至少也要7至8萬的價位，未來只要進一步開發量產的方法、簡化量化的步驟和流程，台灣以價格低廉、品質優良的蘭花品種，進軍國際花卉市場，一定相當具有競爭力，目前已經有四家廠商表達高度的興趣，希望移轉這項技術。「未來一株拖鞋蘭賣五塊錢也不是不可以，不過，希望這項技術不會讓所有種植蘭花的花農失業！」張唯勤說。蘭花繁殖法「蘭花的繁殖，有分株、無菌發芽及組織培養等幾種方式。」張唯勤指出。所謂的分株，就是將蘭花在植珠基部所形成的側芽，切離母體，使這些側芽單獨存活。這種方法可以取得與母體（母代）性狀一致的下一代，缺點是繁殖的數量很有限，一年只能增殖一至兩倍，經濟效益不高。一般來說，蘭花種子內的胚，必須和一種細菌（蘭菌）共生後才會發芽。而無菌發芽，卻是將蘭花種子播種於滅菌過的培養基中，讓培養基中所含的糖類及營養元素取代蘭菌，幫助蘭花種子的胚繼續發芽成株。無菌發芽的方式複製蘭花，可以得到大量的種苗，但種子本身經由有性生殖而來，經過基因重組的過程，因此，無法得到與母代性狀一致的下一代，讓優良的蘭花品種繁衍至下一代。目前商業栽培的蘭花，大多以組織培養的方式繁殖，也就是取植物的細胞、組織或器官進行體外培養，以取得性狀及遺傳特性一致的植株，這種技術已經廣泛地應用在植物的繁殖及育種上。另外，也有人以芽體增殖的組織培養方式複製蘭花，例如，蝴蝶蘭便是利用花梗芽進行繁殖，不過，這種方法的繁殖效率較差，成本也較高。目前以細胞來複製蘭花仍僅限於文心蘭、素心蘭及蝴蝶蘭等，幾種品種。
張唯勤Dr. Wei-chin Chang
學歷：美國加州大學河邊分校植物生理系博士
台灣大學園藝系學士
經歷：美國加州大學河邊分校、猷他州立大學博士後研究員
中央研究院植物研究所研究員
特殊成就：1980年曾經有一篇《人參開花》的論文，創下台灣第一個學術性論文刊登在《Nature》上的先例。
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陳健忠 助理教授 最高學歷：國立台灣大學農學博士學術專長：植物生理、植物生長與分化、植物形態發生、植物組織培養、植物基因轉殖、掃描式電子顯微鏡、蘭花細胞培養教授課程：普通生物學、藥用植物學
（一）文心蘭之試管內形態發生：已建立文心蘭主要品種（Oncidium Gower Ramsey）及盆花品種（Onc.Sweet Sugar）體胚發生之再生體系（Chen et al., 1999; Chen
& Chang, 2000a,b）。並利用這些再生系統進行一系列的形態發生研究（Chen & Chang, 2001; 2002; 2003a,b; 2004）。目前已獲得高效率的直接體胚發生體系，長度約 1 公分的葉片培植體可形成數十個體胚（如圖），而每個體胚皆可長成完整的植株。未來將進行文心蘭試管內開花的誘導，並利用葉培植體直接體胚發生之再生體系（Chen et al., 1999），進行基因轉殖之相關研究。（二）蝴蝶蘭重複性胚發生之再生體系：以白花蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）原球體進行誘導，成功獲得重複性胚發生之再生體系（Chen & Chang, 2004），本論文內容之掃描式電子顯微鏡圖片獲選為 In Vitro-Plant 之封面。此再生系統的優點是不需經過植株開花、授粉及結果及播種之過程，即可在短時間重複獲得大量的胚，適合作為胚形態發生及相關生理現象之研究。（三）蝴蝶蘭葉培植體直接體胚發生與基因轉殖：蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis & Phalaenopsis
Little Steve）幼葉培植體不經由癒傷組織，直接自葉表面及切口處形成體胚，這些再生體胚最後發育成為形態正常的小植株（Kuo et al., in press; Chen
& Chang, in press）。未來將進行一系列培養環境、培養基成分及生長調節劑等因子的測試，以期提高體胚發生的效率。目前已應用此再生體系進行素心蘭嵌紋病毒鞘蛋白基因（CymMV CP gene）之轉殖。（四）拖鞋蘭之細胞培養：由於組織培養技術尚未成熟，拖鞋蘭目前仍以無菌播種為最主要的繁殖方式。近年來，雖有經原球體來源癒傷組織、叢生芽及葉片獲得小植株的報導（Lin et al., 2000; Chen et
al., 2002; 2004），其繁殖效率仍有待提升。未來將朝細胞懸浮培養及體胚發生誘導等方向進行研究，以期發展出具實用價值的拖鞋蘭無性繁殖體系。（五）石斛蘭直接體胚發生與植株再生：已建立石斛蘭（Dendrobium Chiengmai Pink）直接體胚發生之再生系統，並探討生長調節劑對於體胚發生效率之影響（Chung et al., in press），未來將進一步測試其他培養條件，並將此技術應用至藥用石斛之相關研究上。（六）蘭花細胞培養系統之建立：蘭花是植物界最大的科之一，除了文心蘭、蝴蝶蘭及拖鞋蘭等目前在台灣較為重要外，尚有許多具潛力的種類有待開發。未來將蒐集珍稀的蘭花品種，進行細胞培養等相關的研究，以期對種原保存、種苗繁殖及生物技術研究有所助益。（七）檳榔之試管內形態發生：檳榔（Areca catechu L.）是台灣相當重要的經濟作物，目前繁殖方式大多是從種子發芽而來，姑且不論其在社會上之評價為何，單純就學術研究角度而言，檳榔的試管內形態發生是一個相當有趣的題目。取頂芽、種胚、根、莖葉進行癒傷組織的誘導，再經由芽體形成或體胚發生的途徑獲得植株，目前已獲得成功（Wang et al., 2003a,b; Wang
et al., in press），未來將針對重複性胚發生或試管內開花等生理現象進行深入研究。
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