試管內的花花世界─ 蘭花的複製─
蘭花是植物界最大的科之一，包含了兩千五百多種。從陰暗潮濕的熱帶雨林、險峻的懸崖峭壁到乾旱的沙漠地帶，都可以探尋到它的芳蹤。變化多端的花形以及五彩繽紛的花色，是蘭花最吸引人的地方。有些蘭花是以花朵的形狀來命名，例如文心蘭，又稱跳舞蘭，因為它的花朵形狀像極了一個正在跳舞的女孩；又如拖鞋蘭、蜘蛛蘭及蝴蝶蘭等也是。此外，亦有以花色命名者，例如非洲豹紋蘭以其紅色斑紋而得名。台灣地處亞熱帶，氣候適合蘭花生長，已成功進行多種蘭花的商業栽培，例如，揚名國際的蝴蝶蘭、外銷日本的文心蘭，以及具有發展潛力的拖鞋蘭等。蘭花的繁殖有分株、無菌發芽及組織培養等方式。許多蘭花每年會在植株的基部形成側芽，分株就是將這些側芽切離母體，並使這些側芽能夠單獨存活。採用這種方法可以獲得與母本性狀一致的下一代，但是繁殖的數量卻極為有限，在大多數的情況下，每年只能增殖一到兩倍左右。除了分株以外，無菌發芽是另一個繁殖蘭花的方法。蘭花的種子內含未成熟的胚，在自然界中必須和蘭菌共生之後才得以發芽生長。無菌發芽的方式是將蘭花種子播於已滅菌過的培養基中，而培養基當中所含的糖類及營養元素等成分，可以取代蘭菌的作用，幫助未成熟的胚發芽生長。採用這種方法雖然可以得到大量的種苗，但是，種子本身是經由有性繁殖而來，已經過基因重組，所以無法得到遺傳組成一致的下一代，如此一來，優良的品種便無法保存繁殖，而有些蘭花的種子發芽率較低，也是一大限制。目前商業栽培的蘭花多以組織培養的方式進行繁殖，採取植物的細胞、組織或器官進行體外培養，進而獲取性狀及遺傳物質一致的植株，這種方法已經被廣泛地應用在植物的繁殖及育種等領域上。近年來，生物技術快速發展，以基因工程的方法可以加速作物的改良。如果要應用基因轉殖的方法進行蘭花的育種，必須先建立一個經由細胞來繁殖蘭花的系統。此外，以細胞為起始點來繁殖蘭花，可以獲得大量遺傳組成一致的種苗，不但可以將優良的品種大量複製，並且對於提升種苗繁殖效率，以及降低成本等方面都有極大的幫助。
植物的組織培養複製動物在目前或許還算是大消息，但是，複製植物老早就不是新聞了。植物經由扦插、壓條或分株等營養繁殖的方法，可以獲得性狀相同的營養系，許多植物便是依賴這種方法來繁殖。自從組織培養的技術開始發展之後，經由細胞、組織或器官獲得大量的營養系更是輕而易舉。欲以組織培養的方法來繁殖植物，首先必須取得培植體，培植體為自植物體上獲取的細胞、組織或器官。將這些培植體置於人工培養基上，經過一段時間的培養之後，可由傷口誘生癒傷組織。癒傷組織是指未有任何型態的細胞團，這些細胞團有再生為植株的潛力，將此種細胞團培養在合適的培養基上，可經由器官發生的過程形成花、根或芽等，或經由體胚發生的途徑形成體胚。先形成根者必須再誘導使其生成地上部，才能獲得一棵完整的小植株。反之，先形成芽體者必須再誘導使其生根，才得到完整的小植株。一般認為，器官發生的過程乃源自多個細胞，並不適合做為基因轉殖的材料，例如，當外來基因轉殖進入其中一個細胞，此一細胞又與其它未轉殖成功的細胞共同形成器官，則形成所謂的嵌鑲體。而體胚發生則是所培養的體細胞經過一連串類似有性胚發育的過程而形成小植株。理論上，每個細胞都可以形成一個體胚，而每一個體胚都可以發育成為一棵完整的小植株，這種過程並未經過授精作用，其遺傳物質並未發生重組，所以經由體胚發生的繁殖過程可以獲得大量且遺傳組成一致的小植株。此外，此種從單一體細胞發育成為完整植株的繁殖方式，非常適合做為基因轉殖的起始點，因為只要將外來基因轉殖進入單一體細胞，便可以經由體胚發生來獲得再生的轉殖植株，並且沒有發生嵌鑲體的疑慮。
蘭花的組織培養法國人莫瑞爾（G. M. Morel）首先將組織培養的技術應用在蘭花上，採取莖頂組織進行培養，經由類原球體而獲得植株。利用組織培養進行芽體增殖是另一個獲取種苗的方法，例如，蝴蝶蘭便利用花梗芽進行繁殖，這種方法的缺點是繁殖的效率較差，而且成本較高。由於芽體是經由多細胞發育而成，並不適合做為基因轉殖的材料。以單細胞做為基因轉殖的起始點是最好的方式，而且可以避免得到嵌鑲體。不過，目前以細胞來複製蘭花還個體胚。接下來的工作便是將這些體胚培育成為完整的小植株，通常需將體胚轉移至另一不同配方的培養基。體胚逐漸發育形成原球體。這些自體細胞而來的原球體和種子發育而來的原球體，在形態及發育能力上並沒有明顯的差異，兩者皆可以發育成為正常的植物。只是同一來源的體細胞所形成的原球體具有相同的遺傳組成，而種子來源的原球體則皆具有不同的遺傳組成。數個月後，原球體發育成為具有地下部及地上部的小植株，待小植株成長至一定大小後，便可以進行馴化的工作。將小植株移出瓶外，種植於栽培容器並只局限於幾個種類，如文心蘭、素心蘭及蝴蝶蘭等，無法廣泛使用。
以細胞複製蘭花以細胞複製文心蘭為例，可以採取花梗、根、莖及葉做為培植體，將這些培植體置於合適的人工培養基，一至兩個月後，癒傷組織從根尖、莖及葉培植體的切口部位長出。這些誘導出來的癒傷組織可以不斷地繼代培養於相同的培養基，形成更多的癒傷組織，而且數年之內仍具有再生植株的能力。如此一來，我們便可以維持複製文心蘭的系統，不需要每次都從培植體去誘導新的癒傷組織。獲得大量癒傷組織後，便要進行體胚誘導的工作。一般而言，誘導體胚所需要的培養基配方會不同於繼代培養時所用的。將癒傷組織轉移至誘導體胚的培養基，大約一個月後，可以觀察體胚的形成。理論上，每個細胞都可以產生一個體胚，所以一小塊癒傷組織便可以誘導出數十甚至數百個體胚。接下來的工作便是將這些體胚培育成為完整的小植株通常需將體胚轉移至另一不同配方的培養基。體胚逐漸發育形成原球體。這些自體細胞而來的原球體和種子發育而來的原球體，在形態及發育能力上並沒有明顯的差異，兩者皆可以發育成為正常的植物。只是同一來源的體細胞所形成的原球體具有相同的遺傳組成，而種子來源的原球體則皆具有不同的遺傳組成。數個月後，原球體發育成為具有地下部及地上部的小植株，待小植株成長至一定大小後，便可以進行馴化的工作。將小植株移出瓶外，種植於栽培容器並移至具有遮陰及噴霧設施的溫室進行馴化，可以得到將近百分之百的存活率。除了以細胞複製文心蘭之外，素心蘭、蝴蝶蘭及拖鞋蘭等都可以經由癒傷組織誘導出小植株，這些小植株也都能正常的生長。素心蘭的癒傷組織是從根莖等營養器官誘導而來的，癒傷組織在繼代的過程中形成體胚，這些體胚並不形成原球體而是發育成為根莖，然後才形成小植株。雖然蝴蝶蘭及拖鞋蘭都可以利用癒傷組織來繁殖，但未來仍需進一步以營養器官或組織來誘導癒傷組織，才能針對特定的優良品種進行繁殖。
葉細胞再生植株除了藉由誘導癒傷組織來再生小植株之外，還有另外一種不需經由癒傷組織便可以誘導培植體形成體激下，容易導致體細胞變異，遺傳物質產生改變的體細胞會再生出變異的小植株，而葉細胞直接形成體胚則比較穩定。在合適的條件下，理論上每個葉細胞都會形成一個體胚，一片葉子便可以複製出成千上萬棵性狀及遺傳物質相同的小植株，而這些小植株的葉片也可以再用來誘導體胚發生。如果在場地及人力等條件胚發生，進而再生植株的方法，這種過程稱為直接體胚發生。文心蘭葉片的直接體胚發生是蘭科植物中，唯一曾被報導的例子。誘導的方法非常簡單，將文心蘭的葉片切下做為培植體，培養在一般不含植物生長調節劑的培養基，大約一個月後，葉片的尖端、上表面及切口部位可形成體胚，將帶有體胚的葉片繼代至相同的培養基，經過數星期之後，體胚發育成為原球體，原球體逐漸抽芽長大，最後則形成正常的小植株，移至塑膠盆內進行馴化，可以得到高存活率。以掃描式電子顯微鏡觀察體胚的形態，可以看到大量的體胚從葉表面長出，這些體胚大小不一，顯示並非同步形成，初期形狀有一點像釋迦果。除了葉表面之外，葉尖端也是一個很容易形成體胚的部位。以直接體胚發生來繁殖文心蘭具有多項優點，首先是這種方法的繁殖速率較快，從誘導培植體形成體胚至小植株出瓶馴化，最快僅需五到六個月左右的時間。此外，經由直接體胚發生所獲得的小植株之變異機率較低，因為癒傷組織經過長期的繼代，在生長調節劑或高鹽類等條件刺都能配合的情況下，繁殖倍率可以等比級數上升，想要有多少種苗都不成問題。如果能將這種繁殖方法應用在其它的蘭花上，有一天當我們看到一棵非常漂亮的蘭花，只要想辦法取得它一小片葉子，便可以很快地複製出許多一模一樣的蘭花了。
未來的路怎麼走雖然我們已經可以利用癒傷組織來繁殖文心蘭、素心蘭、蝴蝶蘭及拖鞋蘭，但對其形態發生的過程並不十分清楚，這部分必須要再進行更深入的探討，才能將這些繁殖系統做更有效的應用。除此之外，細胞懸浮培養也是未來研究的重點。所謂細胞懸浮培養是將癒傷組織培養在液體培養基，並置放在震盪的培養架上，促使細胞團塊崩解而獲得分離的單一細胞，最後再將這些單一細胞培養成為小植株。如此一來，不但能夠在極小的空間裡培養出大量的種苗，而且可以確保這些植株是從單一細胞發育而來。最後，期望這些複製蘭花的技術除了用在商業栽培外，並能應用在育種及基因轉殖等方面，以提高種苗的繁殖效率，培育出抗蟲、抗病、易栽培、高產量且更美麗的蘭花。□
陳健忠張唯勤中央研究院植物研究所
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