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石斛是我國重要的傳統中藥材，具有抗腫瘤、增強機體免疫能力，擴張血管、抗氧化等藥效，其藥用價值歷代為人們所推崇。是《中國藥典》(2000年版)[1]中規定的石斛原植物 ,也是石斛藥材中的主流種類，其有效成分主要有生物鹼和多醣，前者俱有鎮痛解熱作用，可降低心率、血壓，減慢呼吸，可產生中度的高血糖，具強壯作用並可解巴比妥中毒，後者可增強機體免疫功能[2]。
貴州赤水是的原產地之一，已有百餘年的傳統。隨著中藥現代化的開展，已成為貴州省開展GAP規範化的主要藥材品種。目前，由於對有效成分積累規律缺乏認識，在各個基地均普遍存在種源混亂、盲目栽種和隨意收割等問題，未能有效發揮的藥用價值，質量得不到保證。因此，本文試圖通過對不同地域、不同生境、不同發育期體內生物鹼和水溶性多醣積累的研究，為貴州省的GAP規範化提供科學數據。
1 材料與儀器
1.1 材料採自貴州赤水，用於對比的來自四川合江、雲南思茅和貴州羅甸。
1.2 儀器BP61S型電子天平(德國Satoris，精確度0.001g);7551型紫外可見分光光度計(惠普上海分析儀器有限);電子恆溫水浴鍋(深圳市沙頭角國華儀器廠);加樣槍( 10，20，100，200，1 000 μl)(法國Gilson);恆溫烘箱;索氏提取器;回流裝置;乾燥器;pH計等。
2 方法
2.1 樣品製備取鮮品，105℃殺青30 min，60℃烘乾至恆重，粉碎，過60目篩。
2.2 生物鹼含量測定參照金蓉鸞等[3]的方法。準確稱取粗粉0.500 g ，置於150 ml磨口平底燒瓶中，用5 ml氨水濕潤，密塞放置30 min，加氯仿10.0 ml，稱重，置80℃水浴鍋上回流提取2 h，冷卻後稱重，補充氯仿至原重，過濾。精確量取濾液1.0 ml，用氯仿稀釋至25 ml，搖勻，取10 ml於60 ml分液漏斗中，加入pH4.5緩衝液5.0 ml和0.04%溴甲酚綠1.0 ml，劇烈振搖3 min，靜置30 min，氯仿層用氯仿浸泡處理並乾燥後的藥棉過濾，取濾液6.0 ml，加入0.01 mol/L NaOH的無水乙醇液1.0 ml，搖勻。於波長620 nm處測得吸收度。以石斛鹼作為內標繪製標準曲線。總生物鹼含量(以石斛鹼計，%)=(樣品液吸收度×20 μg×稀釋倍數)/(標準品吸收度×樣品重)×100%。
2.3 水溶性多醣含量測定參照李滿飛[4]、李合生[5]和陳毓荃[6]等的方法。稱取粗粉0.100 g，在索氏抽取器中用80%乙醇於78℃水浴鍋上回流提取3 h。將裝有樣品的濾紙包於105℃烘乾，加40 ml重蒸水，沸水浴提取3 h，趁熱過濾，收集濾液。合併濾液，定容至1 000 ml。精密吸取樣液1 ml，加苯酚試液0.5 ml，搖勻，迅速滴加濃硫酸2.5 ml，搖勻，靜置5 min，沸水浴15 min，迅速冷卻至室溫，於490 nm處測定吸光度。以葡萄糖作為標準繪製標準曲線。多醣的含量(%)=[(從標準曲線查得糖的含量/ 測定用樣品液的體積)×提取液體積×稀釋倍數/樣品重量×106]×100%。
2.4 統計分析將所得數據經EXCEL2003和SPSS15.0進行統計分析。
3 結果
3.1 產地對有效成分累積的影響不同地區生物鹼和水溶性多醣含量因立地條件、氣候的不同而有差異(表1)。結果顯示，思茅產的生物鹼含量最高，其乾重和鮮重百分含量分別為0.510 0%和0.086 3%;羅甸產生物鹼含量最低，其乾重和鮮重中生物鹼含量分別為0.266 7%和0.043 0 %。由方差分析可看出，如果以乾重計算，羅甸產的生物鹼含量與赤水、合江、思茅產生物鹼含量存在極顯著差異;如果以鮮重計算，則羅甸產與思茅產之間存在顯著差異。表1 不同產地生物鹼、水溶性多醣含量
3.2 附生基質對有效成分累積的影響以貴州赤水產為實驗材料，研究了附生於岩石和樹幹上的體內生物鹼和水溶性多醣累積的影響(表2)。方差分析結果顯示，雖然附生基質不影響體內生物鹼的單位鮮重含量(F=4.200)，但是，卻極顯著影響生物鹼的單位乾重含量(F=52.364)。以乾重計算，附生岩石和附生樹上的生物鹼百分乾重分別為0.486 7%和0.406 7%，前者為後者的1.2倍。同樣，方差分析表明附生基質對體內水溶性多醣的累積過程沒有顯著影響。表2 附生基質對有效成分累積的影響
3.3 環境對有效成分累積的影響在溫室中馴化與野外相比，前者俱有方便、成本低、利於控製石斛生長條件的優勢。但兩種環境下的有效成分含量才是決定何者更為科學，更有利於提高藥用價值的標準。以貴州赤水產為實驗材料，研究了野外和溫室過程中的體內生物鹼和水溶性多醣的累積(表3)。結果表明，環境顯著影響水溶性多醣含量，但對生物鹼累積沒有顯著影響。特別是以乾重計算，野外和溫室條件下水溶性多醣含量分別為2.325 0%和2.106 7%，前者為後者的1.1%，存在極顯著差異(F=42.735)。表3 環境對有效成分累積的影響
3.4 生長期對有效成分累積的影響不同生長期對赤水中的生物鹼和水溶性多醣累積的影響見圖1。結果顯示，隨著生長期的延長，生物鹼逐漸積累，在3月齡體內生物鹼含量只有0.09%，但在3年齡體內生物鹼含量達到0.53%，兩者相差5.9倍。相反，體內水溶性多醣累積出現先增加後降低的趨勢，在第1年基本達到飽和，在第2年達2.83%為最高值，但在3年齡體內水溶性多醣含量則降低到2.25%。
4 討論
生物鹼和水溶性多醣是藥材石斛的主要有效成分，它們在體內含量的高低直接影響到藥材質量，因此，本文研究對於產地選擇和規範化具有現實的指導意義。我們的研究表明，生物鹼含量順序為雲南思茅>貴州赤水>四川合江>貴州羅甸，而水溶性多醣含量則為貴州赤水>雲南思茅>貴州羅甸>四川合江(表1)，由此可見，赤水是貴州理想的生產地。貴州赤水、雲南思茅產有效成分含量的差異，可能與生長區的氣候條件、光照、水分等的差異有關。圖1 生長期對有效成分積累的影響
在貴州赤水，喜生於岩石或林中樹幹上[7,8]，因此，我們研究了附生於岩石和樹幹上的有效成分，發現附生於岩石上的其生物鹼含量明顯高於附生於樹幹上的植株，但是水溶性多醣含量則無明顯差異(表2)。與樹幹相比，岩石表面土壤層有機質極度匱乏，水分短缺，溫差變化大，由此猜想生物鹼的累積是否與其抵抗逆境的生理響應有關。但是，野外和溫室試驗結果表明，不斷變化的野外環境條件並沒有刺激或誘導生物鹼累積(表3)。在對不同生長期有效成分的研究中，發現無論是生物鹼還是可溶性多醣，其含量均在生長的第一年出現較大增長，以後出現緩慢增長或下降(表4)，推測有效成分的累積可能受植物發育過程的調控。
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