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迎接21世紀現代林木生物技術育種的挑戰

施季森

南京林業大學

摘　要：林木組織培養及其工廠化育苗技術，細胞工程種苗工廠化生產新技術，林木體細胞胚胎發生、植株再生和人工種子技術，林木原生質體培養和細胞雜交，體細胞突變體的篩選與利用和林木基因工程育種等是林業面向21世紀的新型產業關鍵技術。21世紀我國林業生物技術育種，要充分重視擁有自主知識產權的林木基因和基因工程品種培育, 同時林木基因工程應從單基因生物抗性轉向持久抗性，生物抗性轉向非生物因數抗性；要重視優良基因型的體細胞胚胎發生工程的實用化和自動化研究、常規育種技術與現代生物技術的有機結合，林木轉基因植株的環境安全性評估問題也應予以重視。

一、傳統生物技術正在向現代生物技術轉變

傳統生物技術（或稱生物工程學，Biotechnology）的原始應用雖可以追溯久遠，但現代生物技術主要是指近20～30年以來，生命科學領域內微生物學、遺傳學、生物化學、細胞生物學和分子生物學在理論和方法、乃至電腦和資訊學的技術革命，從而形成的現代高技術，主要包括基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程和生化工程。林業生物工程技術的應用，特別是在應用生物工程技術進行林木新品種的培育和改良、林產工業生產中的環境污染的生物技術淨化、木質生物原料生物工程技術加工和能源轉化等方面都具有十分廣闊的前景。
    生物技術作為20世紀人類科技事業最偉大的成就之一，不僅正在推動著世界經濟和社會的發展，也對整個國際科技戰略發展格局產生著深遠的影響。因此，許多國家把發展生物技術作為重要國策，以期在國際競爭中長期佔據有利地位。世界許多著名的企業都紛紛注入鉅資投資生物技術產業。據不完全估計，到2000年世界生物技術市場約為4 000億美元，21世紀世界農產品的產量增長89%～90%將主要來自生物工程技術；2020年70%的農作物品種將是基因工程品種。農業、林業、環保和海洋生物技術將成為繼醫藥生物技術浪潮之後的第二浪潮，我們必須清晰地意識到中國的林木育種業也如同其他生命科學領域一樣，面臨21世紀從傳統生物技術向現代生物技術轉變和迅猛發展的挑戰。
現代生物技術在林木遺傳育種中的應用，主要涉及細胞工程、基因工程及其相關的前沿領域。

二、國內外林木生物技術育種的現狀與進展

（一）林木組織培養及其工廠化育苗技術

自20世紀60年代以來利用組織培養再生植株的植物種類已達到近1 000種，其中木本植物達200多種，並且在不斷增加。美國1978年已開始用火炬松優樹的組培苗進行小面積造林，1983年其裏格斯苗圃就有100萬株組培苗的生產規模；新西蘭林業研究中心用組培方法生產優質輻射松苗，目前達200萬株左右；另外，德國、法國、加拿大和巴西等在三倍體山楊、雲杉、楊樹、桉樹等樹種的組培方面進行了較為系統的研究，使林木組織培養苗木進入工廠化和實用化階段。
20世紀70年代以來，我國開展了這方面的研究。先後分別有楊屬、杉木、馬尾松、泡桐、桉樹、落葉松、火炬松、濕地松、馬褂木、柚木、竹子和桑樹等樹種從器官、莖尖、成熟胚、花藥和愈傷組織誘導成苗。自1983年國家實施“六五”林業科技攻關計畫以來，我國的林木組培育苗研究已從實驗室走向工廠化大生產，分別在華南和華北地區建立了具有國際先進水準的，年產桉樹組培苗250萬株、楊樹組培苗150萬株的全自動控制育苗工廠。與此同時，一些地方性的林業生物技術產業也有很好的發展，生產的組培苗木被廣泛應用于國家林業兩大體系的建設和世界銀行貸款造林專案的實施，尤其在南方商品林如桉樹商品林基地建設中起了十分重要的作用。在林木組織培養技術的基礎上，發展出的一系列基因轉移、DNA直接導入技術成為基因工程的核心技術，組織培養也成為生物技術的重要組成部分。

（二）細胞工程種苗工廠化生產新技術

1．林木體細胞胚胎發生、植株再生和人工種子技術

體細胞胚胎發生和植株再生以及人工種子技術的思想，主要來源於1902年Haberlandt提出的植物細胞的全能性理論。由於植物每一個體細胞從理論上都存在誘導成胚的可能性，具有繁殖速度快、不受地區、季節和氣候性災害等自然條件的限制；對於木本植物來說，不必等待漫長的有性時代，一旦獲得優良材料就可以比常規繁殖快數十倍甚至上百倍的速度繁殖，因此具有十分誘人的潛力。林木的體細胞胚胎發生始於20世紀70年代後期，90年代初得到迅速的發展，並獲得了極大的成功。全世界目前已有40多種木本植物獲得了體細胞胚，尤其是用常規無性繁殖技術很難生根的針葉樹的體胚發生取得了令人矚目的進展。據初步統計，已從冷杉屬、落葉松屬、雲杉屬、松屬、黃杉屬和北美紅杉屬的至少20種不同的針葉樹的外植體誘導成功了體細胞胚。在闊葉樹種上，楊屬、柳屬、栗屬、檀香屬、楓香屬、鵝掌楸屬、榛屬、櫟屬、板栗屬、刺槐屬、山茶屬、桉樹屬、七葉樹屬、柑橘屬、柚木、油棕、可哥、油橄欖、橡膠、泡桐等20多個樹種的組織培養中觀察到體細胞胚胎發生或獲得再生植株。其中，美國的惠豪公司、國際紙業公司、維斯瓦庫公司和加拿大的一些公司、新西蘭林業研究中心等已分別將火炬松、挪威雲杉、花旗松和輻射松等樹種的體細胞胚誘導和植株再生應用於生產實踐。僅新西蘭一家公司就已形成了年產200萬株輻射松體細胞胚再生植株的能力。

我國目前林木體細胞胚胎發生和植株再生技術研究，見報道的有中國科學院遺傳所、中國科學院上海植物生理研究所和中國科學院植物所等單位，涉及的樹種有雲杉屬火炬松、馬尾松、黑穗醋栗、桉樹、桃樹等樹種等，南京林業大學等單位正在進行楓香、鵝掌楸、杉木和馬尾松等樹種體細胞胚胎發生和植株再生技術研究。

人工種子的研究進展相對緩慢一些。研究進展受到兩個方面的影響，一是體細胞胚胎形成後可以直接誘導再生成苗，而不一定要走人工種子的技術路線；二是製備人工種子的包裹材料及附加成分組成人工胚乳和人工種衣的技術尚未成熟，人工種子的轉株率低。國內木本植物目前僅見貢柑和赤桉的報導，轉株率分別達到30%～70%和80%～90%。據加拿大有關學者認為，在人工種衣技術成熟以前，可以採用體細胞胚胎培養與直接誘導成苗技術相結合的技術路線，應用于林業生產實踐，體胚的轉株率較高，成本較合理。1個10～15 cm直徑的培養皿內可誘導出上千個胚和近千株苗木，完全可以滿足1 hm²造林用苗，可見成熟的體細胞胚胎發生和誘導成苗技術的種苗繁殖效率是相當高的。

2．林木原生質體培養、細胞雜交和體細胞突變體的篩選與利用

林木植物的細胞具有細胞壁，不能直接進行細胞融合而獲得細胞雜種。自1960年英國的Cocking首次用纖維素酶從番茄根分離得到原生質體後，開創了林木原生質體分離、培養和細胞雜交的新時期。目前有320多種高等植物的原生質體培養再生植株成功，但在木本植物方面起步較晚，難度較大，進展不快。到目前為止，世界上木本植物僅見五種柳丁、三種柑子、蘋果、枇杷、桑樹、歐洲山楊及其它楊屬樹種、榆樹、懸鈴木、泡桐和獼猴桃等樹種報導，其中用材樹種僅有六種。南京林業大學與中國科學院上海植物生理研究所合作，先後獲得了楊樹、桑樹、泡桐和懸鈴木等用材樹種的原生質體；最近，南京林業大學報導成功地進行了美洲黑楊與小葉楊原生質體分離、培養，美洲黑楊與胡楊、美洲黑楊與青楊的原生質體融合和細胞雜交研究，為林木遠緣雜交和新品種培育展示了廣闊的前景。

組織培養過程中，離體組織和細胞在一定的誘導條件下，可產生遠高於自然突變的體細胞突變頻率，為林木的遺傳改良提供了重要的選擇來源。國內外研究人員利用體細胞無性系變異體、突變體進行林木抗病、抗除草劑、抗鹽鹼和提高次生代謝物含量的篩選研究。先後篩選出了楊樹抗病、抗除草劑新無性系，抗北美五針松皰銹病新無性系。中國林科院和南京林業大學進行了耐鹽體細胞突變體篩選的研究，獲得了一批體細胞變異體。

（三）林木基因工程育種是林業面向21世紀的新型產業

在林業生物技術中，上述的組織培養、體細胞胚胎發生和單純的原生質體培養植株再生技術基本上是屬於利用現有的遺傳資源，加以快速繁殖利用，而在這些技術的基礎上發展起來的各種將外源基因導入林木細胞的遺傳轉化技術，為林木育種工作者創造了新的遺傳變異和育種資源，使林木育種真正深入到生物技術育種的水準，為發展面向21世紀的林業產業提供了技術基礎。

1．林木遺傳轉化

遺傳轉化技術是將動物、微生物和植物本身的基因，通過遺傳轉化方法將異源基因導入樹木，並使得這些基因在合適的調控順序下在異源植物的細胞中表達。以農桿菌Ti質粒和Ri質粒經改建後作為載體的遺傳轉化系統，成功地轉化了大多數試驗過的雙子葉植物和裸子植物。遺傳轉化的方法已從最初的農桿菌介導法發展了多種DNA直接轉化法，如原生質體電激穿孔法、PEG法和微注射法、基因槍技術以及最新發展起來的低能等離子束法等。成功進行遺傳轉化的樹種分別有楊屬、落葉松屬、雲杉屬、松屬、栗屬、胡桃、刺槐、榿木、桉樹、蘋果、李和葡萄等20多個樹種。利用DNA直接轉化導入異源基因時,可能插入核基因組,也可能插入細胞質基因組,因而基因的表達存在不確定性。而農桿菌介導的基因轉移通常只能插入核基因組之中，因此目前報導成功的轉基因植物近80%是採用農桿菌介導的遺傳轉化。我國的科學家在“七五”、“八五”和“九五”攻關期間，成功地進行了楊樹、松樹和桉樹等樹種的遺傳轉化，系統掌握了各種遺傳轉化技術體系，為開輾轉基因工程的實際應用奠定了基礎。

2．林木基因工程

林木基因工程是通過適合的基因轉移技術，導入有用的外源基因，獲得轉基因植株，進行林木遺傳改良或有關的研究。1986～1997年期間，全世界有45個國家在60多種植物上進行了25 000例轉基因植物的田間試驗，僅1996～1997年即約有10 000例左右的報導，約占40%。1997年底，全球已有12種作物的48種轉基因作物產品獲准進入商品化生產，轉基因植物種植面積達1 280萬hm²，僅美國就占60%。據估計全球轉基因植物產品的市場銷售額從1996年的不足5億美元，到2000年將增加到70億～100億美元。可見轉基因工程是目前國際競爭最激烈的生命科學領域之一。世界上林木的基因工程主要集中在抗病基因工程、抗蟲基因工程、抗除草劑基因工程、抗逆基因工程、品質改良基因工程等方面。

（1）抗病基因工程　迄今為止，植物抗病基因工程大多也是依據農桿菌Ti質粒為載體的隨機整合策略。樹木的抗病基因工程根據樹木感染的是病毒、細菌或真菌病害不同而採取不同的策略。抗病毒病害基因工程所選用的目的基因，主要有衛星RNA，外殼蛋白基因、反義RNA、PR蛋白基因、中和抗體基因、弱毒株系、干擾素基因等；抗真菌性病害的目的基因來自植物內、外源的病原菌的頡抗蛋白和毒蛋白基因，病原菌特異激發子的編碼基因，病菌蛋白酶抑制劑基因以及病原和寄主中過敏反應的控制基因等。細菌性的病害的基因工程主要採取對病原細菌有解毒作用的解毒活性基因和T4溶菌酶基因等方法。抗林木病毒性病害的基因尚未很好研究和克隆，抗真菌性和細菌性的基因研究有一定的進展。抗真菌性的病害研究方面目前克隆出的基因有幾丁質酶基因和角質酶基因，已構建了能在楊樹細胞中表達的幾丁質酶基因的表達系統；誘導或激發樹木本身防衛系統啟動，涉及木質素、黃酮類色素和植保素的合成的酶類基因如苯丙氨酸胺裂解酶、查爾酮合成酶、水楊酸合成酶基因，微生物源、動物（如昆蟲、兔防禦素基因）異源、植物異源次生代謝物合成基因的研究等研究對林木抗病基因工程具有重要意義。目前國內外轉基因的抗楊樹葉銹病、抗楊樹葉枯病、抗日本山楊腫瘤病、抗栗疫病、南方松梭形銹病、抗桉樹青枯病等轉基因的轉基因樹木正在試驗中。

（2）抗蟲基因工程　1988年美國依阿華大學首先利用從馬鈴薯中提取的蛋白抑制劑基因，以農桿菌Ti質粒為載體轉化楊樹雜種無性系，獲得抗卡那黴素植株；1990年我國的南京林業大學將農桿菌C58菌株轉入小葉楊和歐美楊，將農桿菌Ri質粒系統轉入毛白楊分別獲得成功。1991年Mcoown BH等人利用電激法將抗蟲Bt基因導入銀白楊與大齒楊、歐洲黑楊與毛果楊的雜種，並獲得抗蟲轉基因植株；美國威斯康星大學麥迪森分校成功地將抗蟲Bt基因、蛋白酶抑制劑基因（CPTI）導入白雲杉中，有效地防止了卷葉蛾的危害；1993～1997年間，中國林科院與中國科學院合作將Bt基因導入歐洲黑楊、歐美楊和美州黑楊，獲得對舞毒蛾有毒殺作用的楊樹轉化再生植株，並進入田間測定。中國科學院、中國林科院、南京林業大學、中國農科院等單位，先後單獨或合作研究獲得了轉抗蟲基因的黑楊、歐美楊雜種、毛白楊、美洲黑楊與小葉楊雜種NL-80106，以及轉Aalt蠍神經毒素基因的NL-80106楊樹無性系，並進入田間試驗階段。初步結果表明，楊樹轉基因無性系的抗蟲效果顯著，為解決楊樹人工林的大面積蟲害創造了條件。

（3）抗除草劑基因工程　1987年美國首次報導成功地將抗除草劑基因導入銀白楊與大齒楊的雜種無性系中並進入田間試驗，隨後美國又成功地將抗除草劑的基因轉入美洲黑楊、落葉松，引發了一場轉基因工程的熱潮和企業界的關注。目前，轉基因的美州黑楊已在密西西比河流域的一些企業應用。

（4）抗逆性基因工程　我國在包括木本植物在內的許多植物對逆境條件的反應研究中，取得了重要進展，已有研究表明，不同條件的逆境條件脅迫引起的反應有許多相似之處。例如，乾旱、鹽鹼和低溫等不同的逆境都引起滲透脅迫。目前參與植物對滲透脅迫反應的ABA調節，調滲蛋白，與抗逆代謝相關的基因如與抗（耐）鹽有關的脯氨酸合成酶基因、與抗凍抗寒相關的魚抗凍蛋白（AFP）基因、甜菜堿、葡萄糖合成酶、與葉綠體甘油-3-磷酸脂醯基轉移酶基因、與抗旱有關的繭蜜糖合成酶基因、與樹木抗污染有關的起活性氧化解毒重要作用的谷光甘肽還原酶基因已被克隆，部分已被轉入樹木。15年來，我國的抗鹽基因工程進展較為明顯。中國科學院、中國農科院等單位克隆和合成了脯氨酸合成酶基因（proA）、山菠菜堿脫氫酶（BADH）、磷酸甘露醇脫氫酶(mtlD)及磷酸山梨醇脫氫酶(gutD)等與耐鹽相關基因。通過轉化山菠菜堿脫氫酶（BADH）、磷酸山梨醇脫氫酶(gutD)基因，獲得耐鹽楊樹的研究正在進行之中；南京林業大學還與日本制紙合作開展了抗二氧化硫、臭氧污染的轉基因楊樹研究。但與抗蟲和抗病基因工程相比，抗逆基因工程的研究相對較為薄弱。

（5）木材品質改良基因工程　研究主要集中於與品質有關的控制木材紋理、木材力學性質、木材比重基因，與木材造紙和造紙廢水污染有關的控制木質素合成的基因的分離和克隆。美國北卡洲立大學、密西根技術大學、一些私營企業，匈牙利的林業研究所，日本森林綜合研究所育種中心等在上述方面取得了較大的進展。其中密西根大學 姜立泉 教授領導的研究小組成功地克隆控制楊樹木素合成酶的幾種關鍵基因，經轉移到其他楊樹品種證實，轉基因楊樹木素的含量可降低50%，生長量可提高30%。目前，薑立泉研究小組還將克隆的控制木素合成的基因轉化了落葉松等針葉樹，進入田間試驗。中國林科院、南京林業大學和中國科學院、美國北卡州立大學、密西根技術大學、日本制紙育種研究所等合作，也正在開展控制木素基因及其遺傳轉化的研究。控制木質素合成的基因分離和克隆及基因轉移的突破，將對我國的造紙業原料的供應、降低造紙工業對環境污染治理的壓力有重大意義。

（四）分子遺傳標記圖譜構建和數量性狀基因定位

林木分子遺傳標記技術和分子育種技術是20世紀90年代發展起來的新興生物技術和世界林木育種的發展前沿。是在美國人類基因組計畫（HGP）和人類後基因組計畫的帶動下發展起來的，旨在通過對一些重要模式樹種的基因組結構和功能的分析，分離和克隆來自樹木本身的有用基因，瞭解控制樹木重要性狀的基因之間的相互關係，尋找控制樹木重要性狀的特殊遺傳標記，進行分子標記輔助選擇育種。國際上已有20多個國家開展了30多個樹種的遺傳圖譜的構建和數量性狀基因位點的定位研究，分別在火炬松、濕地松、輻射松、糖松、馬尾松、杉木、楊樹和桉樹等樹種上定位了近千個基因位點，發現了一批與木材品質、抗性等基因緊密連鎖的基因位點。美國北卡州立大學先後發現了與木材性質，對松梢螟、松樹梭形銹病具有緊密關聯的基因位點，進行了分子標記輔助選擇育種的探索。南京林業大學、中國林科院分別與中國科學院合作，構建了美洲黑楊及其雜種、馬尾松、杉木和桉樹的遺傳圖譜，馬褂木的遺傳圖譜也在構建中；根據遺傳圖譜在美洲黑楊及其雜種上初步確定了3個與性別分化、2個與抗楊樹葉枯病有關的QTL基因位點，在杉木上初步分析了遺傳標記與分枝和幹形的關係。