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逆流色譜操作經驗分享 : 高速逆流色譜屬於逆流色譜的範疇，逆流色譜是一種新型的分離手段，它的主要分離原理是利用樣品在固定相和流動相之間的差異也就是分配比不同而進行分離的，值得注意的是逆流色譜的固定相和流動相都是液體，其主要優點是沒有傳統色譜的死吸附，樣品的回收率高等特點。逆流色譜源於逆流分溶法，也就是用實驗室經常使用的分液漏斗進行連續的液液萃取，根據樣品在兩種互不相溶的溶劑中分配比不同而進行分離。逆流色譜早期發展的方法有液滴逆流色譜，旋轉小室逆流色譜等。但是作為一種分離手段，早期發展的逆流色譜不能滿足高效快速的分離，分離的周期很長，效率很低。在70年代，Ito博士成功開發了一種能夠高效快速分離的逆流色譜－高速逆流色譜。但高速逆流色譜也有很多種設計，經過幾十年的發展，現在的高速逆流色譜一般是採用同步行星式的設計，其主要是利用在高速旋轉狀態產生的二維離心力場的作用下使兩種互不相溶的溶劑快速有效的對流或分割----或者說混合或分層，從而使樣品能夠在短時間內進行成千上萬次萃取，根據樣品中的物質分配係數的不同而進行分離的一種方法。HSCCC有幾個突出優點：（1）無不可逆吸附。聚四氟乙烯管中的固定相無需載體液-液色譜系統，故而消除了氣-液和固-液色譜中因使用載體而帶來的吸附現象，特別適於分離極性物質和生物活性物質；（2）高回收率。由於流動相和固定相均為液體，樣品可全部回收，分離純化與製備可同步完成，故特別適於製備性分離；（3 ）操作簡便。因固定相為液體，體系更換與平衡方便、快捷。與HPLC相比，HSCCC進樣量較大，最多可達數克，是HPLC的數百倍；與常壓、低壓色譜相比，HSCCC的分離能力強，有些樣品經一次分離即得到1個甚至多個單體，且分離時間短，數小時即可完成，純度多在98％以上。高速逆流色譜作為一種比較新穎的分離方法，影響因素主要有溶劑體系的選擇，旋轉速度，流動相的流速，溫度等影響。溶劑體系選擇即條件的摸索，相當於傳統色譜摸流動相的條件，不同的是高速逆流色譜條件的摸索主要是指樣品在固定相和流動相兩者之間的分配的比值，待分離的樣品的K值最好在0.6-1.5範圍之內，這樣才會有一個好分離效果。轉速主要體現在固定相的保留率上，一般轉速越高固定相保留率也比較高，分離效果也相對的好一些。流速要適中，太大會降低固定相保留率，太低會容易拖尾。溫度是一個非常重要的參數，溫度恆定對體係得重複性有著決定性的影響，比如說冬天，夏天可能同一個溶劑體係就會有著不同的分離效果。高速逆流色譜在藥物領域主要應用在中草藥，合成藥物，抗生素以及蛋白等領域。在天然產物中應用的更廣泛一些，比如生物鹼、黃酮、香豆素，蒽醌，皂苷，萜類等都有相應的研究。對於每一類的化合物一般都有一些經典的體系，比如說生物鹼用氯仿：甲醇：水（酸水），或者用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水。在低極性的化合物象揮髮油，萜類可以用正己烷：甲醇：水，石油醚：甲醇：水等體系，皂苷一般用乙酸乙酯：正丁醇：水體系。以上我介紹了選擇溶劑系統的一般步驟，主要是查文獻-摸條件-上高速逆流主機-篩選優化體系這幾個步驟。摸條件和上機作實驗是最關鍵的。其實每一類型化合物都有一些比較固定的體系，比如說生物鹼類化合物你可以用氯仿：甲醇：酸水的體系，也可以用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水的體系，還有人用正己烷：正丁醇：水的體系成功分離了石杉鹼甲。具體哪個體系適合，就要看你樣品的具體性質來判定。摸索體係對於初學者可能會比較慢，我覺得慢也不是一件壞事，畢竟是一個經驗積累的過程。摸索條件主要是判斷要的組分的分配係數如何，一般會選在一個比較合適的位置，（0.6-1.5）我們可以通過把體系加入試管當中，然後加入樣品，觀察上下相的顏色，最好在通過薄層看一下斑點大小（取等量的上下相點板）。值得注意的事，選擇體系的時候一般要注意最好先選擇比較經典的體系或者固定相的保留率高的體系。（判斷的一個標準就是上下兩相的比重相差越大，保留一般就會高，最好拿個試管看所選體系的分相時間，最好是小於30秒）比如說氯仿：甲醇：水=4：3：2，正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水=1：1：1：1，乙酸乙酯：正丁醇：水=4：1：5體系。氯仿：甲醇：水系統比較適合中等以上極性物質的分離，如果是酸水的話還可以用來生物鹼的分離。正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水適合分離低，中等極性的物質，根據化合物不同極性作比例的調整。乙酸乙酯：正丁醇：水主要用一些極性比較大化合物的分離。在選擇體系的時候也要注意上下相的比例，一般都是採用輕相做固定相，如果所選擇體系上相很多，下相較少的話，就會比較浪費。關於體系的優化就是為了尋求一個更好的分離效果，這個相對來說比較容易些，可以根據選擇的體系進行比例的調整或者在加入少量的其他溶劑，主要手段就是為了尋求一個更合適的分配係數。除了 ​​體系的調整以外還可以進行流速和溫度的調整來選擇一個比較合適的溶劑系統。Q: 分離皂苷時用的什麼溶劑系統，什麼檢測方式呢？我用的是乙酸乙酯：正丁醇：水的體系，連接的檢測器是ELSD，像有些皂苷類，甾醇類的沒有紫外吸收的，我們一般用ELSD檢測器。分離一些水溶性的物質，我們會加入一些正丁醇，由於正丁醇本身的粘度比較大，所以體系會有一些不穩定，我們一般會把流速降低來增加體系的穩定性以求獲得好的分離效果。如果水溶性更大的，我們可以在體系當中繼續加少量的甲醇，來獲得一個滿意的分配係數.當然分離水溶性的物質我們也可以採用氯仿甲醇水的體系，這個時候甲醇的量應該是比較大的，我看過有體系用氯仿甲醇水分離過黃酮苷類的物質，如果分離效果還不是很明顯的，就是說分離物質在氯仿層的溶解度不是很大的話，我們也可以在體系中加入一些少量的正丁醇，調整一下分配係數，這樣就會有一些好的分離效果.當然甲醇有的時候也可以換成乙醇，有的時候用乙醇能獲得一個比較好的分離效果。其實丙酮也能用來分離，但是如果用紫外檢測器的話，可能丙酮由於末端吸收會干擾物質的信號在逆流色譜當中用的不是非常多。如果用的檢測器是ELSD的話這樣丙酮就可以使用。Q: HPLC的泵、檢測器是否可以和HSCCC聯用？主要要考慮的因素是什麼呢？HPLC的泵理論上是可以跟HSCCC連用的，但要注意，由於HPLC的泵是耐高壓的，而HSCCC所用的管材是塑料的，經不起高壓，所以在聯用的時候一定要注意，不要讓管路堵塞了。另外要注意HPLC的泵在不接柱的情況下的泵壓，我曾見過有人用安捷倫的泵接HSCCC，結果爆管了，一檢查，泵一工作壓力就有4MP。HPLC的檢測器與HSCCC的聯用有如下問題要注意，HSCCC上的樣品較雜，我們知道，HSCCC的管路直徑有1.5厘米，有些許不溶物進入管路不影響分離，但HPLC檢測器流通池的容積只有5-8微升，這樣就有堵塞的可能，一旦堵塞，要么爆管，要么爆流通池。另外HSCCC所用的試劑都是AR的，用HPLC檢測器檢測靈敏度太高，而HSCCC分離的樣品量也較大，HPLC的檢測器的量程可能不夠。還有就是HSCCC所用的兩相溶劑，在運動過程中產生劇烈的混合，因而溶劑不可避免的要產生一些乳化，甚至會產生一些流失，這樣HPLC檢測器得到的圖譜會非常的難看。高速逆流色譜在醫藥領域的使用範圍，總結一下有： 1、中藥領域（應用比較廣泛，生物鹼，黃酮，香豆素，糖苷等分離較多，水溶性很大的物質報導的不多）。 2、抗生素領域，有相關的文獻報導。（據我了解，已經有些人在這方面做了很多的研究） 3、蛋白質類物質，雙水相體系分離用逆流色譜分離的文獻報導不多。
這種分類其實是不完全的，因為分離可以應用到很多方面，比如說分離藥物代謝產物方面也是一種方向。逆流色譜對於製備分離內源性物質也有著自己的優勢。因為本身的代謝產物含量少，富集分離困難，高速逆流色譜由於具有高回收率等，樣品預處理簡單等特點，能夠快速的富集到相應的產物，然後再作進一步的分離。