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服務公司：深圳市同田生化技術有限公司
電子郵件：tauto@szonlin.net 深圳市同田生化技術有限公司成立於1999年2月份，現位於深圳市高新技術產業園清華大學研究院內，是世界上第一家多分離柱高速逆流色譜儀的專業生產企業，公司擁有自主知識產權的多分離柱高速逆流色譜專利技術，現已研製並生產出ＴＢＥ系列分析型、半製備型、製備型高速逆流色譜儀，其技術已達國際領先水準。2002年同田生化與安瑪西亞中國有限公司建立合作夥伴關係，合作推出AKTA-TBE300A高速逆流色譜系統。高速逆流色譜主要用於生物化學、農業、海洋生物、無機化學等領域，特別在中藥領域中已被認為是一種新型有效的檢測和分離純化技術，我公司已利用高速逆流色譜分離出十餘種植物有效單體產品，如：異鼠李素、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、大豆甙、大豆甙元、染料木甙、染料木素、虎杖甙、蛻皮甾酮等，純度均達99％以上，可用於有效成份的純度對照。深圳市同田生化技術有限公司是一家專業生產植物有效成份對照品的公司，現有銀杏黃酮對照品：異鼠李素、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、山萘酚、槲皮素現貨提供，純度均達到99%以上，可用於銀杏黃酮的純度對照及保健品，亦能根據用戶的需要開發新產品。公司還研製了系列具有自我知識產權的新型高速逆流色譜系統（HSCCC），能為廣大科研院所提供最先進的分離純化設備。歡迎廣大新老客戶來電來函與我們建立良好的貿易合作關係！
本文作者等用國產分析型TBE-300高速逆流色譜儀（深圳同田生化技術有限公司）對含環孢菌素A、B、C、D的混合物進行分離，以石油醚/丙酮/水（V/V 3：3：2）為溶劑系統，下相為流動相，運行8小時後，得到純度大於98.5%的A、B、C、D各組分，收率 高於85 %。事實證明高速逆流色譜技術在抗生素分離純化方面大有可為。四．逆流色譜技術的新進展1.梯度洗脫逆流色譜：高速逆流色譜通常使用恆定比例的溶劑系統，但是對於組分極性變化大的樣品，用恆定比例的溶劑系統難以達到分離效果。此時可以像HPLC一樣採用梯度洗脫的方法進行分離。先用簡單的梯度洗脫系統如水-乙腈（100:0?O:100）用HPLC對樣品進行極性掃描分析，選擇適當的溶劑系統，如正己烷-正丁醇-甲醇-水（極性化合物）；正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（中極性化合物）和正己烷-乙腈（非極性化合物），然後逐漸改變系統中某一溶劑的比例，如將正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系中甲醇的比例從0.1逐漸提高到2.5並求出不同甲醇比例時的分配係數以優化溶劑系統，最終得出最佳梯度洗脫系統。花色素苷(anthocyanins)是一種類黃酮類植物色素，是很好的抗氧化劑和自由基清除劑。由於結構中羥基和糖苷基的數目不同而使各組分的極性不同。以乙酸乙酯-正丁醇-水(0.2%TFA)為溶劑系統，採用逐漸提高流動相中正丁醇比例的方法對樣品進行梯度洗脫逆流色譜，一次既可分離出5個活性成分。2. pH區帶逆流色譜：pH區帶逆流色譜(pH-zone-refining CCC)的洗脫色譜圖形與頂替色譜和等速電泳相似，主要組分的峰組成一系列矩形色譜峰，各色譜峰之間很少重疊，一般針對可離子化的分子如羧酸、胺等。操作時選擇兩相體系如甲基叔丁基醚-水，平衡後取上層溶劑加入適量的作為“保留劑”的酸如三氟乙酸並作為固定相，下層溶劑加入適量的作為“取代劑”的鹼如氨水並作為流動相。以分離有機酸R1COOH、R2COOH、R3COOH（pKa1《pKa2《pKa3）為例（圖1），首先將酸化的固定相注入色譜柱中，然後加入用固定相溶解的樣品。泵入流動相後，在色譜柱足夠長的情況下整個體系達到“等速”狀態，與氨水界面移動的速度同步。酸性較強的R1COOH先與氨水作用，轉化為R1COO-和NH4+，但R1COO-隨即被酸性更強的CF3COOH質子化，又變為R1COOH回到固定相，CF3COO-和NH4+先洗脫出。同樣，在CF3COOH消耗完變為CF3COO-後，R1COOH提供質子，使R2COO-轉化為R1COOH留在固定相，直至所有的R1COOH轉變為R1COO-，並隨流動相洗脫出，形成R1COO-的矩形色譜峰。與此類推，其次洗脫出的是R2COO-矩形峰，最後是R3COO-的矩形峰。由於在所有的R1COOH轉變為R1COO-前，R2COO-不會洗脫出，因此，R1COO-在色譜圖上形成矩形峰，與R2COO-很少重疊，R2COO-和R3COO-的峰也是如此。圖1 pH區帶逆流色譜分離有機酸示意圖 同樣，若被分離的樣品是鹼類如生物鹼等，也可以鹼為保留劑，酸為取代劑，進行pH區帶逆流色譜分離。此外，也可以選擇下相溶劑為固定相，上相溶劑為流動相，因此，pH區帶逆流色譜擴大了逆流色譜的應用範圍，提高了樣品的進樣量，可進行製備性的樣品分離，在氨基酸及其衍生物、多肽、氧雜蔥染料、生物鹼、多酚和異黃酮類等化合物的分離方面得到應用。如用正丁醇-0.03mol三氟乙酸(1:1)分離了粘菌素；用正丁醇-0.2mol甲酸氨分離了縮膽囊素。pH區帶逆流色譜也可以用於有機酸對映體的分離，如下圖中1-甲基-4-甲氧甲基環己基甲酸的兩個異構體由於立體位阻效應不同而使酸性產生差異，從而得到分離。3.離子交換頂替離心分配色譜:離子交換頂替離心分配色譜(Ion-exchange displacement CPC)的原理與pH區帶逆流色譜相同，但後者針對可離子化的分子如羧酸和胺類，而前者特指離子化的化合物即在任何pH值的情況下都帶電的化合物如有機磺酸鹽和季胺鹽等。從褐色海藻中提取出一種多取代硫酸多醣，以硫酸岩藻糖為基本單元的聚合體上還含有半乳糖、木糖和醣醛酸。這種帶多個負電荷的高極性聚合物(Fn-, Fn-1-, F2-, F1-等)易溶於水，不適合用離心分配色譜等進行分離，但引入離子交換頂替方法後可以用CPC等逆流色譜予以分離。操作中採用了一種液相離子交換樹脂Amberlite LA2，這是一種高分子油溶性二級胺，在大部分有機溶劑中溶解性良好而在水相中溶解性極低。將LA2溶解在甲基異丁基酮等有機溶劑中並用鹽酸質子化，將有機相作為固定相，樣品用固定相溶解後注入色譜柱，以含OH-的溶液為流動相進行離子交換頂替離心分配色譜分離，其分離原理與pH區帶逆流色譜相同（圖2），最終被樹脂吸附最弱的多醣先洗脫出，最後出來的是吸附最強的組分。圖2離子交換頂替離心分配色譜分離硫酸多醣示意圖4.手性分離逆流色譜:手性分離技術已經在高壓液相（HPLC）、氣相(GC)和毛細管電泳(CE)中得到廣泛應用，但在逆流色譜中應用很少。主要困難在於尋找適合的手性選擇劑，它們在液相和混合溶劑中都要有很高的選擇性，並且能將所要分離的手性異構體洗脫出。儘管進展不大，但下列開拓性的工作值得重視：源自HPLC技術的以N-十二烷酰-L-脯氨酰-3,5-二甲基苯胺和萬古黴素為手性選擇劑的工作以及源自CE技術的以?-環糊精為手性選擇劑的工作。
N-十二烷酰-L-脯氨酰-3,5-二甲基苯胺是?電子供體化合物，能將天然氨基酸的N-(3,5-二硝基苯甲酰基)-叔丁基衍生物（DNB-氨基酸）的對映體快速和完全分離。研究發現若增加固定相中手性選擇劑的量或濃度以及調整溶劑系統的憎水性使對映體的分配係數在0.6和0.8之間（pH區帶逆流色譜除外）的話，可以在330mL的色譜柱中用CCC儀器將1克的DNB-氨基酸外消旋體分離，採用pH區帶逆流色譜，分離量可達2克。(3R,4R)-7-des-methyl-ormeloxifene是部分雌激素受體激動劑(-)-(3R,4R)-levormeloxifene的主要體內代謝產物，對(3R,4R)-7-des-methyl-ormeloxifene及其(3S,4S)的對映體進行毛細管電泳分離時，以硫酸化?-環糊精為手性選擇劑，分離度可增加十倍，達到100以上。但毛細管電泳的分離量太少，於是，將此技術應用於逆流色譜，選擇取代度為7到11的硫酸化?-環糊精為手性選擇劑，以10:1:9的乙酸乙酯—甲醇—三乙銨乙酸鹽溶液為溶劑系統並在固定相中加入2%(W/V)的硫酸化?-環糊精，可很好地將上述對映體拆分。
萬古黴素作為一種通用和高效的手性選擇劑已應用於液相色譜、薄層色譜和毛細管電泳，並成功地拆分了許多對映體如氯殺鼠靈、華法林、萘氧丙草胺、5-甲基-5-苯基乙內酰脲和各種氨基酸衍生物。萬古黴素易溶於水，在甲醇中也有一定的溶解度，但不溶於高級醇和其它較低極性的有機溶劑。因此，以萬古黴素為手性選擇劑進行CCC和CPC拆分時，通常採用兩相繫統：含萬古黴素的水相固定相和富含對映體的低極性的有機流動相。這樣，分配係數K值在0.5到1之間，有利於快速回收。採用甲苯和140mg/ml萬古黴素溶液（pH4.7）組成的兩相繫統，分別以CCC儀器（13mL分離柱）和CPC儀器(90mL分離柱)對正亮氨酸的丹磺酰衍生物進行對映體拆分。由於D對映體傾向於保留在萬古黴素溶液相中，而L對映體傾向於保留在有機相中，因此，D,L對映體與作為固定相的萬古黴素溶液一起注入，當L對映體隨有機流動相洗脫出後，以有機相為固定相，萬古黴素溶液相為流動相，將D對映體洗脫出，達到拆分目的。使用CPC儀器，在50分鐘內可將50毫克的對映體拆分開。雖然上述逆流色譜新技術的應用與其它色譜新技術相比，還有待於普及和推廣，特別是在抗生素分離純化方面，更顯得薄弱不足。希望抗生素界的廣大同行一起努力，學習、應用和推廣逆流色譜這一分離技術，使它在抗生素行業異軍突起，生根發芽，發揮它應有的作用。致謝：本所方東昇工程師在本文的寫作過程中給予許多幫助，並在高速逆流色譜分離環孢菌素混合物中做了具體工作，特此致謝。----------------------------------------------------------
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