病毒檢測技術在種苗產業之應用!!!.......種苗改良繁殖場
種苗為農業生產的根本，世界 各國為有效提高農作物的產值，皆十分重視健康種苗管理之措施，近年來，我國亦積極推動健康種苗驗證制度，並 配合 以農藥控制媒介昆蟲之族群、抗病品種的育成等預防措施，期能減少種傳病毒病害在田間的發生率。
種子傳播病毒病害最早紀錄於西元 1919 年，由美國植物病理學會會刊首次報導瓜類及菜豆種子可傳播病毒之報告，後經學者陸續研究發現目前共有 108 種種傳病毒，其中有 22 種在我國境內發生。植物病毒每年在全球作物上造成近百億美元之直接或間接損失，如美國番茄斑萎病毒 ( Tomato spotted wilt virus , TSWV) 每季可造成 100 萬美元的損失； 2003 年澳洲因小麥條斑嵌紋病毒（ Wheat streak mosaic virus , 簡稱 WSMV ）導致小麥育種計畫無法有效執行。
台灣由於地處熱帶與亞熱帶地區，氣候非常溫暖潮濕，農作物易遭受病蟲害的侵害，尤其因植物病毒所造成的作物損害甚為嚴重，如胡瓜嵌紋病毒（ Cucumber mosaic virus , 簡稱 CMV ）與番茄黃化捲葉病毒（ Tomato yellow leaf curl virus , 簡稱 TYLCV ）複合感染番茄植株時，不但使番茄葉片呈杯狀或鞋帶狀，嚴重時會使番茄果實減產；蕙蘭嵌紋病毒 ( Cymbidium mosaic virus, 簡稱 CymMV) 感染蘭花時，會在花瓣、葉片上呈現壞疽斑點，因而破壞商品價值。 2006 年台灣南部地區所栽種的洋香瓜，更因洋香瓜病毒病害的疫情升高，明顯造成洋香瓜大量減產。
為因應我國自加入世界貿易組織（ World Trade Organizatio n ， 簡稱 WTO ）以來，農產品貿易量大幅的成長，再加上各國實施健康種苗驗證制度之潮流，如何研發正確且有效的植物病毒快速檢測方法實有其必要性。本文主要目的在於綜合報導植物病毒血清與分子檢測技術及我國種苗驗證體系在產業之應用，祈有助於農民對種苗驗證重要性的瞭解與協助種苗的永續經營。
植物病毒血清與分子檢測技術
為生產符合規定的健康種苗，須先行親本的病毒檢測，確定無病毒後，才能進行組織培養，並進入大量繁殖的階段，因此，病毒檢測技術實為作物邁向健康種苗產業之重要關鍵。植物病毒檢測診斷技術包括：病徵診斷法、生物檢定法、病毒內含體診斷技術、電子顯微鏡技術、血清檢定法與核酸檢測技術，其中病徵診斷法與內含體觀察須由經驗豐富者判斷，且部分植物病毒病害的病徵與微量元素缺乏引起的病徵相似，易致誤判；生物檢定法雖然成本低廉，但是須有隔離溫（網）室及 7 ~ 10 天觀察期；電子顯微鏡不但造價昂貴且須專人操作，恐怕無法應用於產業界，目前仍以學術性觀察病毒顆粒之研究為主。
鑒於植物病毒顆粒結構主要以外部的鞘蛋白及內部的核酸為主，因此植物病毒檢測技術可分為 2 個主流：一為針對鞘蛋白的抗血清檢定技術，以酵素連結抗體吸附反應（ Enzyme-linked immunosobent assay, 簡稱 ELISA ）為主；另一則針對內部核酸物質的核酸檢測技術，以反轉錄核酸聚合脢連鎖反應（ Reverse transcription- PCR ， 簡稱 RT-PCR ）為主。近年，隨著動植物疫病快速檢測診斷之需求，學者更將分子生物學、酵素動力學、電子學、光學與訊號處理等技術結合成生物晶片 (Biochip) ，應用於植物病毒的檢測。以下針對 ELISA 、 RT-PCR 及生物晶片等植物病毒檢測技術加以介紹：
一 . ELISA
此技術係利用抗體與抗原的專一性結合，經由標定於抗體上酵素之作用，將檢測結果以顏色變化呈現，輔以儀器讀取其吸光度數據，俾憑判斷正負反應。因其抗體抗原結合順序差異或酵素連接抗體與抗原的直接與間接性，又可分為直接法與間接法，目前以間接法應用較廣。此技術不僅具有快速、專一、方便及經濟等特性，更適用於大量樣品之病毒檢測，加上結果之再現性與穩定性均深獲各界肯定，因此，此技術已被種苗業界廣泛使用。
二 . RT-PCR
核酸檢測法係建立於物種間獨特的核酸序列，然後依此序列設計出該物種人工合成的短片段專一性核酸引子對，再配合核酸聚合酵素連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, 簡稱 PCR) 技術，此技術乃利用一種分離自細菌的耐高溫核酸複製酵素，在適宜的變溫循環程式下，針對目標病毒的特定區域核酸進行快速複製，約經 2 小時 30 個循環左右，即可複製出約 2 30（約 10 億）倍的核酸，再經由電泳分析以肉眼判別所增幅的核酸條帶。植物病毒核酸大多屬於 RNA ，故在變溫循環前，須先以病毒反轉錄酵素（ reverse transcription ）進行 RT-PCR ，將 RNA 反轉錄成 DNA 分子。
由於基因體核酸乃各種病毒蛋白前驅物，而 PCR 係針對病毒核酸分子進行檢測，因此理論上比 ELISA 技術更敏感，可更早偵測到病毒的存在。
三 . 生物晶片
生物晶片是提供生物分子定性定量分析之小型反應裝置，將 DNA 或蛋白質等生物材料，藉由機械以陣矩（ array ）形式密集點佈在固體材質（如載玻片）上，可用於檢測蛋白質、核酸或組織等生物或醫學檢體，現已被廣泛應用在醫學診斷。生物晶片依種類分為 cDNA 晶片（ complementary DNA chip ）、寡核酸晶片（ oligonucleotide chip ）、蛋白質晶片（ protein chip ）和微實驗室晶片（ lab-on-a-chip ）等，其中以 cDNA 與寡核酸晶片發展較為精進，通稱為 DNA 晶片（ DNA chip ），其所依據的原理，即利用 DNA 互補股（ complementary strands ）之間會專一性相互配對黏合的特性，先用不同方法將已知序列的單股 DNA 合成或固定在晶片上，稱為探針 DNA （ probe DNA ），在進行植物病毒檢測時，多會先萃取病毒核酸之後，進行 PCR 增幅反應，一方面藉以增加敏感度，另一方面則在於將增幅之核酸標定上螢光或其他呈色反應物，使之在與探針 DNA 結合後，可以藉觀察其於晶片上呈色的位置，判定病毒種類，例如農試所開發可同時檢測 2 種蘭花病毒 (CymMV 及 ORSV) 之生物晶片檢測系統，該項技術已進行量產及商業推廣。
四 . 未來植物病毒檢測技術的發展
自 1980 年代起， ELISA 技術即為種苗業界接受度最高、應用最廣泛的檢測方法，使得相關耗材、儀器及藥品產業一直蓬勃發展；由於 ELISA 技術之關鍵在於病毒檢測用抗體的品質，因此也帶動了各國植物病毒檢測抗體及試劑相關產業的發展。惟 ELISA 適用於大量樣品的檢測，為配合種苗培育現場少量樣品快速檢測的需求，近年來亦有廠商開發「免疫試紙條」，此類檢測套組具有可於常溫運送、操作簡便、反應時間短等優點，且敏感度亦不差；然此類檢測套組僅可供現場人員參考，不適用於健康種苗繁殖前之親本病毒檢測。
而核酸檢測自 90 年代初，即有許多研究如雨後春筍般發展，早期以應用互補序列之核酸探針技術為主，此方法雖然較血清免疫技術敏感，但因使用放射線物質而有安全與環保顧慮，後來改以非放射物質標定。 PCR 技術自發明以來，不但提昇了植物病毒檢測敏感度，有效減少病毒漏檢的風險，亦使檢測技術多元化，因而相關產業的發展較 ELISA 更為快速；雖然 PCR 技術成本仍較偏高，且無法進行大量樣品的病毒檢測，不過，因其敏感度高，除了可考慮用於重要種源或組織培養之親本的病毒篩檢，未來朝可於單一反應檢測 2 種以上病毒的多目標型 RT-PCR （ multiplex RT-PCR ）技術方向研發，以節省成本。
隨著我國政府相關單位持續推動建設台灣科技島與對生物科技未來發展之重視，以及市場上對快速檢測產品的需求，開發生物晶片檢測系統，可一次檢測多種病毒，並省略之後的電泳分析，不但操作簡便，且增加檢測敏感度，另一方面更適用大量樣品之病毒檢測；惟其研發成本較高，各國多於檢疫單位、農業機構與大企業使用，且約 8 成的生物晶片仍在研發階段，未來如若廣泛應用於種苗產業，有賴政府持續的重視與推動商品化的腳步。
為配合田間防疫及邊境檢疫工作之需，提昇植物病毒基礎研究質量、進行跨領域整合以標準化檢測流程、以及改進檢測效能，研發符合高敏感度、快速、操作簡便、一次可檢測多種目標病毒等趨勢的植物病毒檢測技術，以提供作物病毒檢測，預防潛伏性感染，確保種苗品質並防堵境外高危險病原入侵，維護國內農業生產安全。因此，政府相關單位及業者應支持各種植物病毒檢測技術的積極研發，以因應未來農產品國際貿易衍生的防疫檢疫問題。
健康種苗驗證體系在產業之應用
各國健康種苗驗證制度目前皆參考國際種子檢查協會（ International Seed Testing Association ，簡稱 ISTA ）制定之種子檢查規則（ International Rules for Seed Teating ），我國自 1962 年正式加入會員，目前以農委會為授權機構（ Designated Authority ，簡稱 DA ）代表，以農委會種子檢查室為授權檢查室（ Designated Laboratory ，簡稱 DL ），種子檢查室並經該協會認證為准許核發該協會檢查證明文件之實驗室，並依國際種子檢查規則進行種子檢查程序。另外，歐洲暨地中海地區植物保護組織（ European and Mediterranean Plant Protection Organization ，簡稱 EPPO ）也針對 28 種無性繁殖作物種苗建立健康種苗檢查制度，並核發檢疫證明及種子檢查相關證書，確保植物從苗期到生產行銷整個流程之健康狀態，以提升作物在國際間之競爭力。
荷蘭於 1930 年代成立專職的種球檢查實驗室，協助農民栽植健康無病毒的種球，也協助檢查種球病毒感染率，並訂定分級標準制度。荷蘭除設有球根花卉檢查中心（ Dutch Flower Bulb Inspection Service ）外，另設有荷蘭園藝作物檢查服務中心（ Naktuinbouw ），唯一獲得荷蘭政府授權之私人機構，專責其他花卉健康種苗檢查之工作，約可進行 80 種不同花卉病毒檢查及品質認證，並核發不同病毒容許量等級的證書。該中心所核發的證書也獲得歐盟的認可，可在歐盟國家內通行。
我國加入 WTO 後，農作物品質須受國際標準之規範並面對國際間之高度競爭壓力，因此農委會防檢局積極推動植物健康種苗制度，為推動繁殖用植物之特定疫病蟲害檢查與證照業相關事宜，農委會於 86 年召開會議選定馬鈴薯、豇豆及文心蘭等 13 種作物為推動對象，目前已完成火鶴花、文心蘭、蝴蝶蘭、綠竹、豇豆、馬鈴薯、甘藷及柑橘等 8 種作物之病毒驗證須知，並積極規劃推動百香果種苗病毒驗證制度。
一 . 蘭花病毒驗證
隨著近年來花卉產業的蓬勃發展，我國蘭花外銷潛力已不容小覷，以文心蘭、蝴蝶蘭、蕙蘭及拖鞋蘭栽培面積最大，產業最具規模，其中，蝴蝶蘭更經農委會選為外銷旗艦產品，其重要性可見一般。經過業者多年淘汰選育，台灣蘭花品種大多具有感染病毒後於幼株不表現病徵之特性，隨著業者由大型開花株或切花外銷轉型為種苗供應之上游產業，且 9 成蝴蝶蘭種苗係經無性組織培養繁殖，極易感染親本所帶有的病毒，因此種苗病毒檢測即於蘭花品質管制上佔有重要一席。據文獻記載指出蘭花可被 30 種病毒感染，其中以蕙蘭嵌紋病毒（ CymMV ）與齒舌蘭輪斑病毒（ ORSV ）最為普遍，可於蘭花植株上造成系統性感染，使蘭株生長緩慢，葉片上出現嵌紋，條斑、壞疽等病徵，亦可使花色不均、花朵畸形或致提早凋萎，又囿於消費者認知，蘭花品質無法容許絲毫遭受病蟲危害所致之瑕疵，病毒病害嚴重影響蘭花商品價值，對於全球蘭花產業影響也最鉅。在台灣目前除 CymMV 、 ORSV 兩種病毒病害外，尚發現胡瓜嵌紋病毒（簡稱 CMV ）及番椒黃化病毒 ( Capsicum chlorosis tospovirus, 簡稱 CaCV) 病毒病的發生。因此，我國為面對荷蘭以無病毒種苗為賣點的競爭，制定一套蝴蝶蘭或文心蘭種苗病毒驗證制度，期能提昇業者競爭能力，並使我國蘭花種苗品質持續獲得消費國家的認同。
依據行政院農業委員會動植物防疫檢疫局公告之「文心蘭種苗病毒驗證作業須知」及「蝴蝶蘭種苗病毒驗證作業須知」規定，可申請驗證的作物種類係指文心蘭及蝴蝶蘭，申請項目則包括組織培養苗（瓶苗）與組織培養定植苗（定植苗）。申請瓶苗驗證者，於母本進行初代無菌化分生繁殖前 1~2 個月提出申請；申請定植苗驗證者，若源自瓶苗者應於瓶苗出瓶定植前提出；若源自定植苗者，應於移植換盆前提出申請。申請者應填具申請書，載明母本及各階段種苗之檢查時間，向本場提出申請，並繳交檢查費。 1~2 個月，第 1 次檢定採用 ELISA ，第 2 次檢定採用 RT-PCR 。檢定機關完成檢定後 5 個工作日內，將結果通知檢查機關及受理機關，受理機關於接獲結果後 5 個工作日內，通知申請者繳交檢定費，並於申請者繳費後核發結果通知。上揭母本、瓶苗及定植苗所檢定之病毒種類，均為 CymMV 及 ORSV 。其作業流程如圖 1 。
二 . 馬鈴薯病毒驗證
馬鈴薯俗稱洋芋，屬茄科植物，為全球重要糧食作物，性喜涼爽，以台灣秋冬季節較適生產，以中南部包括台中縣、雲林縣及嘉義縣一二期間水田為主要產地。據農糧署資料顯示， 2002 ~ 2006 年台灣地區馬鈴薯栽培面積由 1,667 公頃 成長至 2,075 公頃 ，產量則由 38,331 公噸增加到 49,569 公噸，又 1996 年至 2007 年台灣地區馬鈴薯之農產品批發市場年交易量介於 6,586 公噸至 11,654 公噸，顯示近年來隨著國人飲食西化而有市場需求增加之勢。
馬鈴薯生產方式主為無性繁殖，而病毒病害可藉無性繁殖體傳播，使植株代謝生理失常，造成大量減產，因此，無病毒的健康種薯即為防治病毒病害的關鍵。據研究指出，可感染馬鈴薯之病毒或類病毒計 25 種，各國多以馬鈴薯 A 病毒、馬鈴薯 S 病毒、馬鈴薯 X 病毒、馬鈴薯 Y 病毒以及馬鈴薯捲葉病毒為種薯病毒檢測標的。近年隨著健康種薯需求的增加，台灣地區在農政單位輔導下，由種苗場與中興大學、各地區農會等產官學單位合作，計劃性建構健康種薯生產體系，種苗場場積極扮演生產與品質把關之角色，以組織培養生產瓶苗、於溫室種植基本種，再於網室生產原原種，種苗場每年生產 3,000 公斤以上的無病毒健康種薯，所生產的種薯均經病毒檢測，無病毒檢出者才供地方農會生產原種。防檢局為落實無病毒健康馬鈴薯種薯，已於 2009 年 4 月 6 日 發布「馬鈴薯種薯病害檢定驗證作業須知」，即 申請馬鈴薯種薯驗證者分為基本種薯（ G1 ）、原原種薯（ G2 ）、原種薯（ G3 ）及採種薯（ G4 ）等階段，各階段申請者應於種植前向受理機關（本場）提出申請，填具申請書，載明種薯檢查時間並檢付前一階段種薯合格證明書（ G1 除外），繳交檢查費用；驗證結果於申請人繳交檢定費後由受理機關通知，符合規定之種薯另核發證明書。
三 . 豇豆病毒驗證
豇豆俗稱菜豆（台語），為台灣地區夏季重要的豆類蔬菜之一，栽培期間易感染多種病害，其中以胡瓜嵌紋病毒與黑眼豇豆嵌紋病毒複合感染引起的長豇豆皺葉嵌紋病最為嚴重，影響豆莢產量與品質至鉅，由於農民長年自行留種，市售豇豆種子帶有病毒比率約達 10 ％。據本場及農試所的試驗資料顯示，利用無病毒種子栽培，可將栽培末期病毒發病率由 100 ％降至 30 ~ 72 ％，並且能提高產量 11 ~ 74 ％，豆莢重量及長度也較對照組顯著增加，提高農民收益 32 ~ 74 ％。無病毒豇豆種子生產技術經研發成功，深受農民與消費者之肯定，並於 85 年起由本場生產供應推廣使用， 97 年供地方農會生產栽培用種子共 390 公斤 。防檢局為防止病毒藉種子傳播蔓延，已於 92 年訂定之「豇豆種子病毒檢定驗證作業須知」規定，得申請驗證之豇豆種子，分為繁殖用種子及栽培用種子，其作業流程如下：（一）繁殖用種子：申請繁殖用種子驗證者，請於種子繁殖播種前檢具申請書向受理機關（種苗場）提出申請，然後由檢查機關（種苗場）派員赴採種圃檢查其設置，並由檢查機關（種苗場）派員進行採樣，送交檢定機關（農試所）進行病毒檢定。檢定機關以 ELISA 進行 BLCMV 及 CMV 檢測後，將結果通知種苗場，種苗場於接獲結果後 7 個工作日內通知申請人繳交檢定費，並於申請人繳費後核發結果通知。經檢定未測出病毒之定植苗由申請人繼續栽培至種子採收。符合規定的種子由受理機關核發證明書，有效期限為 2 年。（二）栽培用種子：申請栽培用種子驗證者，請於種子繁殖播種前檢具核發之繁殖用種子無病毒證明書、申請書向受理機關提出申請，然後由檢查機關派員赴採種圃檢查其設置及栽培管理，若經確認感染病毒之定植苗由申請人立即剷除；若經檢定未測出病毒之定植苗由申請人繼續採收種子 2 個月。符合規定的種子由受理機關核發證明書，有效期限為 2 年。作業流程如圖 2 。
四 . 檢測技術相關產業
鑒於病毒檢測技術於健康種苗產業中所佔角色，以及病毒檢測本身即可發展為一永續經營的產業，包括了供應各種病毒檢測相關試劑與檢測套組、耗材、相關儀器設備，以及提供按件計酬檢測的服務業，各國生技廠商紛紛投身於此。前者以美國 Agdia 公司與德國 Bioreba 公司較著名；後者如荷蘭園藝作物檢測服務中心（簡稱 NAK ），該中心除提供植物病毒及病原檢測服務，亦提供作物栽培諮詢、健康種苗生產規劃、種苗驗證等服務，可說是該國作物健康種苗產業之推手。
隨著檢測技術多元化，許多檢測產品不斷被開發出來，且在準確性及效率上均往前邁一大步，估計全球檢測試劑產品市場約 300 億美元，以美國與日本市場規模最大，我國每年檢測試劑進口值約 60 億元新台幣，自行研發產品值約 27 億元新台幣。現今雖然檢測診斷生技產品主要應用於醫學檢驗，應用在植物病毒之檢測較少，惟所運用之原理大致相同，且農產品國際貿易不斷擴展，植物有害生物的蔓延風險隨之增加，使各國不得不提高警覺，植物病毒檢測技術及相關產品亦漸獲重視，且主管機關為防杜重大有害生物而實施監測計畫，特定植物病毒之檢測產品可有成長的空間。惟國內檢測產品市場能否大幅成長，仍取決於農產品價格高低、病毒變異的快慢、國外開發之技術平台專利費用等因素，另外歐美等國產業已進駐中國及東南亞市場，壓縮了我國產品外銷的競爭空間，業者可考慮與國內學研單位合作，利用現有醫學診斷試劑之量產設備，投入植物病毒檢測產品商業化，以生產具競爭力的產品。
在國內學術研究單位的努力下，我國植物病毒檢測技術之水準與各先進國家幾無軒輊，且具植物病毒檢測研究能力與經驗之人力資源豐沛，由於目前亞洲地區尚未有檢測服務型企業，以國內種苗病毒檢測需求評估，加上許多國家對進出口農產品的重視，未來應有發展此高附加價值企業之潛力。
結語
種苗產業具有技術密集、高產值及國際性等特色，隨著種苗國際貿易日漸擴大，世界各先進國家皆傾力於種苗之研究與開發。台灣地狹人稠，耕地面積有限，而種苗重量輕、體積小、運輸方便，加上台灣在傳統育種及生物技術方面都有優秀人才，故適合發展種苗產業，並藉由健康種苗等措施來強化該產業。目前防檢局已完成火鶴花、文心蘭、綠竹、豇豆、蝴蝶蘭、馬鈴薯、甘藷及柑橘等 8 種作物之種苗驗證規定，規範各級繁殖圃設置管理、檢查程序及方法，以及認證標準等事宜，未來因應具有高經濟潛力之作物種苗健康體系的推動，除篩選抗病品種，先為健康種苗繁殖體系奠下基礎，應先評估病毒危害之臨界值，制定種傳病毒之容許度，並發展經濟實用的病毒檢測技術，鼓勵專利申請與技術移轉，促成檢測產品商品化，參與國際交流並取得國際認證。於產官學三方的相互配合下，推動與國際接軌的種苗驗證制度，一方面提升種苗產業在國際間的競爭力，另一方面擴大植物病毒檢測相關產業之商機，為台灣農業開發新契機。
圖 1 蘭花病毒驗證作業流程
圖 2 豇豆病毒驗證作業流程
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