Rhizopus根黴屬(學名:Rhizopus)真菌主要外觀特徵為具有假根(rhizoid)及匍匐菌絲(stolon)。孢子囊柄(sporangiophore)以單支或數支成束的方式自匍匐菌絲長出,孢子囊柄基部往往與假根基部相對。孢子囊柄不分枝,其頂端有一圓球形孢子囊(sporangium),囊內有許多孢囊孢子(sporangiospore)。孢子囊有囊軸、囊領、囊托等構造,成熟時呈現灰色至褐色。
Trichoderma纖維素酶廣泛存在於自然界的生物體中。細菌、真菌、動物體內等都能產生纖維素酶。一般用於生產的纖維素酶來自於真菌,比較典型的有木酶屬(Trichoderma)、麴黴屬(Aspergillus)和青黴屬(Penicillium)。
Aspergillus米麴菌 米曲黴菌、米麴霉、麴黴菌或麴黴菌。日文名「麹菌」。米麴菌是一種帶有菌絲(hypha)的真菌與黴菌,在中華與日本料理中經常被用來發酵大豆來製作醬油、味噌與甜麵醬
Penicillium青黴菌是最常見的半知菌中的一種。肉眼可見其孢子的顏色為藍綠色,因而得名。但是並非所有青黴屬的黴菌都為藍綠色,也有白色或者綠色。在顯微鏡下,可見其呈筆一樣形狀的筆狀體(penicillus)構造,尖端上帶有孢子。這也就是這種黴菌的學名由來。
植物組培與分解酵素(酶)
纖維素分解酵素(酶)(cellulase)廣泛分佈於昆蟲、軟體動物、原生動物及微生物群。微生物以真菌為最多,此外高溫性放線菌、藻類、酵母、黏菌等也能分泌纖維素分解酵素。纖維素以β-1,4 glucoside結合而成之不溶性物質,必須分解成葡萄糖才能被利用。以處理過的基質及優良酵素在適當反應條件下進行反應,可得到良好的分解效果。纖維素分解酵素之工業生產菌以黴菌及放線菌較為適合,其能在簡單之培養基中生長,分泌大量酵素,且培養後之菌絲容易過濾除去,酵素容易回收。微生物生產纖維素分解酵素之培養方法有固體培養法、液體靜置培養法、液體振盪培養法、液體深部培養法。一般生產酵素時所用培養方法依菌種及酵素性質而不同,有些胞外酵素因振盪培養或深部培養受到所添加之抗泡劑影響,使分泌出來的酵素全部或部分失去活性,只能用靜置培養法才能大量生產酵素。
*固體培養法:在日本Rhizopus、Trichoderma、Aspergillus及Penicillium等菌株是利用製麴式培養法或深部培養法生產酵素.
*深部培養法:適合於此法生產之酵素的菌株包括Trichoderma、Penicillium、Aspergillus及Rhizopus等。此法比固體培養法容易管理,酵素的回收不須經過抽出過程。其他很多酵素的生產也採用此種方法。使用之培養基在日本有專利,成份為營養鹽類添加5﹪、糖蜜及黃豆餅3﹪、小麥麩皮12.5﹪。此外,其他也有以營養鹽類添加濾紙、木屑、稻草作為培養基者。
*半連續性培養法:利用實驗用發酵槽進行半連續式培養生產Trichoderma viride酵素。
*連續性培養法:利用攪拌發酵槽分兩階段連續培養Trichoderma viride QM9414生產酵素。
第一階段利用葡萄糖作為培養基之碳源以增殖菌體。第二階段為酵素的誘導生產,發酵槽內培養菌液由第一階段輸入,同時由供應槽供應木纖維素以作為誘導生產酵素用。
廣泛被研究利用於纖維素之糖化,提高原料中蛋白、脂肪、澱粉和其他有效成份等的抽出率以及改良食品組織和風味等。如葡萄糖之製造、單細胞蛋白質之生產、甘藷澱粉及黃豆蛋白之分離、洋菜之製造、海草膠之製造、綠茶成份之抽出、蔬菜類之加工、酵母消化率之提高等。添加纖維素分解酵素可以改進飼料之攝取量及提高產卵率,利用Trichoderma viridecellulase處理纖維素物質可提高牛的消化率,其他有些品質差的低級飼料如甘蔗渣、鋸屑以氫氧化鈉處理後添加黴菌酵素,也可提高飼料之營養價值及利用率。作為消化劑的酵素包括amylase、protease、lipase等,添加cellulase於這些酵素劑混合使用時,效果良好,具有相乘作用。微生物混合固體醱酵對纖維分解酵素活性之影響Aspergillus sp.與Penicillium
funiculosum混合培養可得到較強之纖維分解酵素活性,且由Asp. sp.與P.
f.混合培養所得到的酵素系統,其最適pH為4,最適作用溫度是60°C,pH4~7間酵素活性較穩定,於50° C下仍能保持80%之活性。Asp. sp.與P.
f.混合培養所得到的酵素系統對無前處理之甘蔗渣即有良好之糖化性,24小時可獲得6%之還原糖,處理過之甘蔗渣甚至可得到將近20%左右之還原糖。微生物間之纖維分解酵素的協同性從土壤中篩選出黴菌和細菌類纖維分解菌,以黴菌和黴菌、黴菌和細菌及三株菌株混合培養的方式,進行纖維分解酵素的生產,再以所得之各酵素活性和菌株單獨培養之各酵素活性,計算協同性(Degree of synergistic effect; DSE),由此推算菌株之搭配所得之各酵素活性是否有協同作用的現象。結果顯示混合培養在各酵素活性上,均有協同效果。另一結果可知,不同菌株混合培養所得之各酵素活性,比單獨培養時之酵素活性高。由搭配培養後之各酵素活性(產量)可知,CMCase有很高的酵素活性,因此很容易啟動酵素水解的第一步驟,即酵素得先吸附到纖維素上,接著經endo- 和exo-glucanase共同作用的結果,產生大量的cellobiose,其為Cellobiase的inducer,可以和repressor結合,而使得repressor脫離啟動合成Cellobiase之operon上,因此可使operon上之operator啟動,使structural
gene進行transcription來產生大量的Cellobiase,其可將cellobiose水解成glucose,而解除endo-
和exo- glucanase的inhibition,再由此三種酵素進行recycle的作用,而將纖維素完全水解。由此可知,菌株的混合培養可提高酵素活性,相對的提高酵素產量。以中溫菌進行盤固草發酵生產纖維素分解酵素及強化蛋白質含量採用台灣栽種面積最廣的牧草盤固草為基質,利用固態發酵,藉由微生物轉化作用,將纖維質轉化成單細胞蛋白質,利用菌體生長時分泌之纖維素分解酵素,進而提昇飼料作物之營養價值。為篩選能以盤固草為基質進行固態醱酵,生產纖維素分解酵素及強化蛋白質含量之菌株,以所分離之168株菌培養於Mandels-Reese培養基,利用剛果紅測試篩選得到纖維素分解活性較高及生長較快之100株分離菌株。從盤固草培養基共挑選出24株,包含3株細菌、5株放線菌及16株真菌,進行以盤固草為基質的固態發酵測試,結果以分離菌株CL3最優。接種分離菌株CL3至盤固草固態培養基中,發現初水分含量為68-72 %、培養於35 ℃、以硫酸銨為氮源和初pH值在6.5~7.0間,培養6天後可將盤固草中粗蛋白質由6.1提昇至16.96%;發酵後每克乾重基3.762Uavicelase4.400UCMCase(Carboxy-methylcellulase)、4.134 U β-glucosidase。進一步以發酵牧草後進行in vitro消化率試驗,其分解率從4.29%上升至17.82%,顯示接種CL3分離株至盤固草確實能提升其牧草飼料的價值,未來可進一步將發酵後之牧草進行活體餵食試驗。以盤固草為基質進行固態醱酵生產纖維素分解酵素及強化蛋白質含量利用台灣地區栽種面積廣泛的牧草盤固草(Digitaria decumbens)為基質,在剛果紅活性測試,28株放線菌分離菌株中,有6株不論在中溫(30℃)或高溫(50℃)下,都具有生長能力與分泌纖維素分解酵素之活性,選擇透明環大於25㎜、菌落大小大於16㎜和透明環與菌落大小比值大於2的6株分離株進行固態醱酵測試,發現以分離株CH18同時在纖維素分解酵素及蛋白質含量強化上有較佳之表現,培養於50 ℃下6天後可增加蛋白質含量2.6 %。經液態培養後發現分離株CH18具有生長快速之特色Avicelase、CMCase和β-glucosidase之最大比活性分別為5.73、7.76和1.18 IU/l,參考菌株Streptomyces thermonitrificans NTU-88之最大比活性則分別為3.21、3.18和1.81
IU/l。將分離株CH 18進一步在盤故草為基質之固態醱酵培養基中,培養後發現當初水分含量為60-70 %、培養於40-60 ℃、添加硫酸銨為氮源並培養6天以上時,較適合進行纖維分解酵素生產及強化蛋白質。耐輻射奇異球菌在纖維素分解上的應用在受輻射污染之地區或一些輻射廢棄物中均含有大量之纖維素,造成廢棄物處理上的極大困擾。一般情形下都只能等輻射強度自然衰退達到背景值後才可進行一般的廢棄物之處理程序。由於傳統分解纖維素之微生物無法在輻射環境下生長,因此造成這些含輻射廢棄物內的有機污染物大量累積。耐輻射奇異球菌 (Deinococcus radiodurans) 對游離性輻射、紫外光及乾旱具有高度的抗性,可利用其特性來處理含輻射之廢棄物。耐輻射奇異球菌在輻射環境下之生長與正常情形下差異不大。纖維分解酵素分解纖維素形成葡萄糖的實驗中發現,酵素活性並未受低劑量輻射影響但會受照射UV而影響酵素活性。若另外加入D. radiodurans或其細胞內粗萃物即可降低UV對酵素活性的影響。Thermotoga maritima纖維分解酵素之基因celA轉殖到E. coli BL21和D. radiodurans中,兩者皆有其酵素活性的表現。 Whole cell照射UV對celA活性並無影響,若將其細胞打破取其粗萃液持續照射UV (強度2.78mw/ cm2) ,則E.
coli之celA活性會大幅降低78 %,而D. radiodurans只降些許約18 %。因此將來D. radiodurans轉殖菌株可被利用在輻射污染的環境下分解廢棄物中的纖維素達到垃圾減量的目的。從堆肥中篩選纖維素分解酵素生產菌及其酵素性質之研究分離採集畜果菜市場廢棄物,再混合猪糞、污泥及茶葉渣的堆肥樣本中所含之纖維素分解酵素生產菌,在30 ℃和50 ℃自堆肥樣本中篩選出具纖維素分解酵素能力之菌落102個,經純化及繼代培養後獲得49株分離菌株,其中24個分離株為中溫纖維素分解菌株,25個分離株為高溫纖維素分解菌株。由菌落外觀判定,49個分離菌株中有19株屬細菌,8株屬真菌以及22株屬放線菌。由固態培養(剛果紅測試)、液態培養之纖維素分解酵素活性試驗、蛋白質分解酵素活性測試及α-澱粉分解酵素活性發現,高溫纖維素分解菌株-H10(放線菌)和中溫纖維素分解菌株-L14(真菌)其生長較快且酵素活性較高,在液態培養時,高溫纖維素分解菌株H10的最適生長溫度為45 ℃,最適生長pH值為7.0,而CMCase、avicelase及β-glucosidase分別在50 ℃、45 ℃及45 ℃下具有較高的酵素活性(分別為2.83 ± 0.26、5.43 ±
0.03及2.77 ±
0.19 U);中溫纖維素分解菌株L14其最適生長溫度為35 ℃,其最適生長酸鹼值為pH 7,CMCase、avicelase及β-glucosidase分別在35 ℃、35 ℃及40 ℃下具有較高的酵素活性(分別為0.96 ± 0.12、3.75
± 0.08及1.25
± 0.02 U)。分離菌株H10和L14的纖維素分解酵素最適作用溫度相同,CMCase為60℃、avicelase及β-glucosidase則是於50 ℃下具有最大的酵素活性。酵素之熱穩定性則隨著酵素保存溫度的上升,酵素殘留活性有降低的趨勢。所篩選的分離菌株H10和L14具有良好纖維素分解酵素活性,同時在高溫時酵素作用表現佳,亦具耐熱性,因此可實際應用於堆肥或其他工業,使纖維素廢棄物能有效地再利用,提高纖維素廢棄物的附加價值,達到資源再利用之目的。嗜高溫放線菌纖維素分解酵素之探討由果菜市場廢棄物堆肥中篩選出之14株嗜高溫放菌以固態培養方式測定其纖維素分解酵素活性,編號53-2之嗜高溫放線菌具有最高活性。由外部形態的觀察,可將編號53-2之嗜高溫放線菌歸類為鏈黴菌屬。
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