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霍山石斛類原球莖在氣升式反應器中補料培養合成多糖 1前 言霍山石斛(Dendrobium huoshanense C. Z. J.
Cheng)屬蘭科石斛屬，是名貴中草藥，產于安徽霍山及臨近地區，其含有水溶性活性多糖、生物鹼等化學成分，具有滋陰、清熱、生津、潤肺、止咳、清音明目等功效.  現代藥理研究證明，石斛多糖具有調節機體免疫功能及顯著提高機體殺傷腫瘤細胞的能力. 由於霍山石斛自然繁殖能力很低，在自然條件下生長緩慢、生長週期長，加上人工大量採集，其自然資源已瀕臨滅絕. 類原球莖是霍山石斛的體細胞胚胎，可由植株的不同部位誘導產生，具有與植株同樣的物質代謝和形態發育潛能，其生長速度快. 通過霍山石斛類原球莖的懸浮培養研究，一方面可以用於霍山石斛試管苗的快速繁殖，另一方面可以用類原球莖來代替原藥材或生產相關的活性成分.  影響類原球莖生長的因素很多，如溫度、溶氧、培養基組分等. 目前對霍山石斛類原球莖的研究還處於搖瓶階段，利用反應器大量培養尚未見報道，對類原球莖生長和多糖合成的調控研究只是通過改變培養基的組分. 查學強等通過改變培養基組成來調控多糖合成，劉詠等通過添加不同激素來調節類原球莖的生長和多糖的合成；黃鸝等研究了金屬離子對類原球莖生長和多糖合成的影響. 本工作在他們的研究基礎上利用 10 L氣升式反應器進行了擴大培養，考察了接種量、通氣量、碳、磷等營養物質對類原球莖生長和多糖合成的影響及其培養過程的動力學特性，確定了類原球莖生長的最佳培養基和操作條件及多糖合成的最佳條件，確定了調控多糖合成的最佳因素，並採用補料培養方式，為調控多糖合成提供新的方法和理論依據.

2.1實驗材料

霍山石斛類原球莖由本實驗室誘導保存，在無激素固體MS培養基中繼代培養，繼代週期為30 d，生長培養基為改良的MS培養基，其中微量元素、有機元素減半，大量元素為(mmol/L)：KNO3
30, MgSO4⋅7H2O 1.5, KH2PO4 2.5, CaCl2⋅2H2O 4.5，蔗糖濃度為30 g/L.

2.2類原球莖懸浮培養條件取生長30 d的類原球莖接種於裝有6 L液體培養基(pH為5.8)的10 L反應中，通氣量為0.5 L/min, (25±2)℃下懸浮培養. 光照週期為14 h/d，日光燈，光強為120 μmol/(m2⋅s)，接種量實驗接種量分別取50, 100, 125, 150 g /L(鮮重)；通氣量實驗通氣量分別為0.1, 0.5, 1.5, 3 L /min；碳源實驗蔗糖濃度分別取20, 30, 40, 50, 70 g /L, KH2PO4濃度為2.5 mmol/L；KH2PO4影響實驗KH2PO4的濃度分別取0.312, 0.625, 1.25, 2.5, 5.0 m mol/L，蔗糖濃度為30 g/L，36 d收穫類原球莖. 做補料培養研究時，第一步培養時間為24~36 d，期間一次性加入合成培養基，培養基體積保持不變，第二步培養時間為18 d.

2.3分析方法

培養結束後，收穫類原球莖，用蒸餾水洗2次，再用濾紙吸幹類原球莖表面的水分後，稱重記為鮮重；把類原球莖置於60℃烘箱中烘至衡重記為幹重. 提取多糖時，把類原球莖用研缽研碎，然後加入一定量的蒸餾水，放入三角瓶中在50∼60℃水浴中提取3次，收集水提液，加95%乙醇至乙醇濃度為80%，過夜沉澱，最後收集沉澱. 沉澱溶于蒸餾水中用Savage法脫蛋白，並用苯酚−硫酸法測定多糖. 培養基中的多糖提取方法同上，培養基中的蔗糖用蒽酮−硫酸法測定，磷酸根離子用磷鉬藍法測定. 所有實驗重複2次.

類原球莖生物量 (g/L)=收穫類原球莖總幹重/接種時培養基體積,

類原球莖增量 (g/L)=收穫類原球莖總幹重−接種時幹重,

多糖總產率 (g/L)=多糖總提取量/接種時培養基體積,

細胞得率係數yc/s (g/g)=生成細胞的品質/消耗蔗糖品質,

多糖得率係數yp/s (g/g)=生成多糖的品質/消耗蔗糖的品質

類原球莖比生長速率μ (d−1)=dX/(Xdt) (X為生物量, t為時間).

3 結果與分析

3.1 接種量對霍山石斛類原球莖生長和多糖合成的影響接種量的大小影響細胞的生長，細胞的生長需要一定的密度，當接種量低於某一臨界值時，細胞就難以生長. 另外相對高的接種量是高密度培養所必需的. 表1 表明了接種量對霍山石斛類原球莖生長和多糖合成的影響. 當接種量在50~ 125 g /L(鮮重)之間時，類原球莖的增加量和生長速率隨著接種量的增大而增大，當接種量達150 g/L 時，類原球莖的增加量又開始下降，生長速率反而降低. 儘管接種量小，倍增時間短，但類原球

莖產率低，在相同的培養時間內細胞增量小，要達到最大細胞鮮重，時間會延長. 從工業化角度來講，培養周期的延長是非常不利的，而過大的接種量也不利於類原球莖的生長. 綜合考慮接種量對類原球莖培養的影響，接種量為100 g/L(鮮重)較為適宜，以下實驗均取接種量為100 g/L(鮮重).

3.2 通氣量對類原球莖生長和多糖合成的影響

表2 反映了通氣量對霍山石斛類原球莖生長和多糖合成的影響. 由表可知，通氣量在0.1 L/min 以上，類原球莖的生長狀態良好，霍山石斛類原球莖的懸浮培養體系粘度低，對氧的傳遞影響小，在較低的通氣量下就能滿足類原球莖的生長；當繼續增大通氣量時，對類原球莖的生長無明顯促進作用，說明霍山石斛類原球莖懸浮培養時對溶氧要求不高. 考慮到較大的通氣量會使水分大量蒸發，所以選0.5 L/min 的通氣量較為適宜.

3.3 蔗糖濃度對類原球莖生長和多糖合成的影響表3 為不同蔗糖濃度對類原球莖生長和多糖積累的影響. 由表可知，隨著蔗糖濃度的增加，生物量不斷增加，當蔗糖濃度為30 g/L 時，生物量達最大，當蔗糖濃度繼續增大時，類原球莖生長受到抑制. 這是由於較高的蔗糖濃度產生了較高的滲透壓，使細胞失水，導致細胞生長緩慢. 隨著蔗糖濃度的增加，多糖產率不斷增加，蔗糖濃度為50 g/L 時，多糖產率最高，較高蔗糖濃度能滿足類原球莖的生長和多糖的積累，當蔗糖濃度繼續增大時，多糖產率又開始下降，這是由於類原球莖在高滲環境中難以生長，從而影響了多糖的積累. 所以，適合類原球莖生長的蔗糖濃度為30 g/L, 而適合多糖積累的蔗糖濃度為50 g/L.

表3 蔗糖濃度對霍山石斛類原球莖生長和多糖合成的影響

3.4 KH2PO4 濃度對類原球莖生長和多糖積累的影響表4 是磷酸鹽對類原球莖生長和多糖積累的影響.由表可知，低濃度磷酸鹽明顯限制類原球莖的生長，隨著磷酸鹽濃度的增大，生物量及細胞的比生長速率開始增大. 磷是構成核酸、磷脂和ATP 的主要成分，在代謝產物合成和能量代謝中對細胞生長具有調節作用，不同的植物對磷的需求是不同的. 當磷酸鹽濃度為2.5mmol/L 時，類原球莖生長快，多糖合成也相應加快，培養基中的碳源一方面維持細胞生長，另一方面用來合成多糖，在培養後期培養基中的碳源被耗盡(由碳源利用率可知)，胞內可溶性單糖得不到補充，此時胞內多糖降解速度加快，提供碳源維持細胞後續生長，最終多糖產率較低；當磷酸鹽濃度為0.312 mmol/L 時，類原球莖生長較慢，碳源消耗也較慢，在培養後期碳源未被耗盡(由碳源利用率可知)，培養基中有足夠的碳源供細胞生長和多糖合成，最終多糖產率較高. 所以2.5 mmol/L的磷酸鹽有利於類原球莖生長，0.312 mmol/L 的磷酸鹽有利於多糖積累.

3.5 霍山石斛類原球莖懸浮培養的動力學特性以生長培養基為基本培養基，考察了霍山石斛類原球莖生長和多糖積累的動力學特性和碳源、磷源消耗.在氣升式反應器中，霍山石斛類原球莖培養週期為36 d左右，活性多糖主要存在於細胞內，基質中的多糖含量很低. 圖1, 2 分別表示了霍山石斛類原球莖懸浮培養過程中，細胞生長、多糖積累和碳源、磷源的消耗情況. 由圖1 可知，培養前6 d 為生長延滯期，之後細胞進入對數生長期. 類原球莖在6~30 d 之間生長最快，30 d 後開始減慢，36 d 左右生物量最大(幹重)，然後進入穩定期.在快速生長初期，多糖合成速度較快，24~30 d 左右產率最大，之後開始下降，這是由於培養基中的殘糖濃度低於一定值時，不能滿足細胞生長和多糖的合成，這時胞內的多糖降解速度加快，多糖產率開始降低.由圖 2 可知，培養基中的蔗糖和KH2PO4 濃度隨著生物量的增加而逐漸下降，24 d 左右KH2PO4 基本被耗盡，30 d 時培養基中的殘糖濃度為6 g/L 左右，此時類原球莖生長變慢，多糖產率開始下降. 多糖的合成和類原球莖的生長既相互聯繫又相互獨立，相對高的生物量是獲得高多糖產率的基礎. 根據霍山石斛類原球莖細胞生長和多糖積累特性，採用兩步法培養方式，通過改變KH2PO4 濃度來調節碳源流向和調控多糖的合成. 第一步用生長培養基進行培養獲得較高的生物量，第二步用合成培養基，即改變KH2PO4 的濃度來調控細胞生長和多糖合成，使之協調進行.

4 結 論

霍山石斛類原球莖懸浮培養過程中，活性多糖的積累不僅與類原球莖的生長有關，而且與培養基組成、培養方式有關. 本工作利用氣升式反應器進行了擴大培養，研究了類原球莖生長和多糖積累特性，通過改變磷酸鹽濃度來調控多糖的合成，並採用了補料方式. 通過補料培養延長了細胞的對數生長期，有效提高了多糖產率，通過補料培養，多糖產率是批式培養的2.6 倍，比文獻提高了近4 倍.