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石斛為蘭科石斛屬植物，是一種重要的大宗中藥材，民間將其稱為藥界大熊貓，與靈芝、人參、冬蟲夏草等並稱為“中華九大仙草”。傳統中醫常將石斛用於滋陰清熱、生津益胃、止咳潤肺，而現代藥理學研究發現石斛具有多種醫藥功效，可預防和治療白內障，擴張血管、降血糖等。

石斛的有效成分主要是多糖和生物堿，其中多糖由於具有抗氧化、免疫增強和抗腫瘤作用而成為研究熱點。馬鞭石斛是四川主產的石斛品種之一，資源非常豐富，被2000年版和2005年版《中國藥典》收載。初步研究表明，馬鞭石斛中含有豐富的多糖類成分，然而目前對馬鞭石斛多糖的提取工藝及活性研究尚未見報道。本實驗旨在熱回流提取基礎上，結合超聲波輔助處理來研究馬鞭石斛多糖的提取工藝，並通過對提取條件的優化，篩選最佳工藝，為馬鞭石斛的進一步開發提供依據。

1 材料與儀器

葡萄糖、苯酚、硫酸、乙醇、石油醚，均為分析純試劑（成都科龍化工）馬鞭石斛（采自四川夾江，並經中國科學院成都生物研究所何濤副研究員鑒定），60 ℃下烘幹並過40目篩。TU-1800S紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器）；RE -52A旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器）；HH-S數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇醫療儀器）；T214分析天平（北京賽多利斯儀器）；KQ-5200超聲波發生裝置（昆山超聲儀器）；6202植物粉碎機（北京環亞天元機械）；AYJ1-1002-U艾柯浦純水儀（重慶頤洋企業發展有限公司）。

2 方法

2.1 超聲波輔助熱回流提取流程馬鞭石斛→60℃幹燥→粉碎過40目篩→稱取石斛幹粉→石油醚回流去脂→80%乙醇回流去低聚糖→超聲波輔助熱回流提取→紫外分光光度計檢測吸光度。

2.2 標準曲線的制備對照品溶液的制備：精密稱取105℃幹燥至恒重的葡萄糖標準品0.025 0 g，加水溶解，250 ml容量瓶定容，即得0.1 mg·ml-1的葡萄糖對照品液。標準曲線的制備：精密量取上述對照品液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml於具塞試管中，分別加水至2.0 ml，各加入5%苯酚溶液1.0 ml，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 ml，搖勻，放置10 min，置40 ℃水浴保溫15 min，取出迅速冷卻至室溫，紫外分光光度計490 nm處測定吸光度，空白對照以2.0 ml蒸餾水代替葡萄糖液(医药学/药学論文 http://big.hi138.com/)。以吸光度為橫坐標，濃度為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為：

Y=0.068 6X-0.000 3（r=0.999）

式中Y——濃度（mg·ml-1）；X——吸光度值（A）多糖的提取率按下式計算：多糖的提取率（%）=濃度×稀釋倍數×樣品溶液體積樣品質量×100%2.3
單因素實驗溫度對多糖提取的影響分別考察40，50，60，70，80 ，90 ℃對多糖提取率的影響。時間對多糖提取的影響主要考察4 ，8，12，16，20，24，28 min 7個水平；以篩選的最佳溫度和提取時間考察超聲波提取次數（1，2，3，4次）對馬鞭石斛多糖提取的影響。

2.4 提取工藝正交實驗設計在單因素實驗基礎上，對提取溫度、提取時間和提取次數進行L9(34)正交實驗，篩選最優提取工藝。對篩選出來的最優提取工藝進行精密度、重復性、穩定性等方法學考察，同時將其與傳統熱回流工藝的提取效率進行比較。

2.5 實驗設計和數據統計分析實驗過程中所有處理都設3個平行樣，實驗數據利用SPSS軟件分析。

3 結果

3.1 單因素實驗

3.1.1 提取溫度對多糖提取的影響以超聲波提取16 min，提取1次，考察溫度對提取率的影響，結果見圖1。隨溫度的升高，多糖的提取率顯著增大，但當溫度達到90℃後，提取率增加不明顯，故選取90 ℃作為提取溫度篩選其他因素。

3.1.2 提取時間對多糖提取的影響以提取溫度90℃，提取1次，考察超聲波提取時間（4，8，12，16，20，24，28 min）對馬鞭石斛多糖提取的影響。結果見圖2。隨提取時間的增加，多糖的提取率顯著增大，但當時間達到16 min後，提取率卻略有降低，故選取16 min作為提取時間篩選其他因素。

3.1.3 提取次數對多糖提取的影響 以提取溫度90 ℃，提取時間16 min，考察超聲波提取次數（1、2、3、4次）對馬鞭石斛多糖提取的影響。結果見圖3。表明隨提取次數的增加，多糖的提取率顯著增大，但提取3次以後，隨著提取次數的增加，提取率增加緩慢。由於提取次數的增加，成本迅速增加，因此實際生產中，提取次數不宜過多，故選擇2～4次來進行正交實驗。

3.2 正交實驗在單因素實驗基礎上，對提取溫度、提取時間和提取次數進行L9(34)正交設計見表1，結果見表2。表1 超聲波輔助提取正交實驗設計，表2 正交實驗結果（略）實驗因素的主次分析：從表2中可知，極差值中RC為17.38，RB為5.46，RA為4.9。說明C因素（提取次數）影響最大，其次是B和A，影響因素主次順序為C>B>A；優水平為A3B 2C 3，即溫度為95 ℃，時間為16 min，提取4次。實驗因素顯著性分析：從表3可知，提取溫度，時間均對馬鞭石斛多糖提取具有顯著影響，而提取次數具有極顯著影響。表3 正交設計方差分析

3.4 穩定性實驗分別在0，30，60，90，120 min檢測按最優提取工藝制備的樣品液的吸光度，考察該方法在120 min內的穩定性。結果表明，樣品吸光度（A）分別為0.415，0.416，0.409，0.407和0.405，樣品吸光度的RSD=1.189%（n=5），不同時間點檢測的樣品液的吸光度值無顯著差異，表明樣品液和標準液在120 min內基本穩定。

3.5 重復性實驗 按照篩選出的最優提取工藝分別制備5份樣品液，測定其吸光度值。5份樣品的吸光度值無顯著差異，RSD=1.700%（n=5），表明該方法具有良好的重現性。

3.6 超聲輔助熱回流提取與傳統熱回流提取效率的比較將篩選出來的最優工藝與傳統熱回流提取2h的提取效率進行比較。結果表明，超聲波輔助熱回流提取法的多糖提取率為（18.64±0.396）%，而傳統熱回流法的提取率為（12.07±0.100）%，說明采用超聲波輔助熱回流提取馬鞭石斛多糖不僅縮短了提取時間，而且顯著增大了提取率。

4 討論

實驗建立了利用超聲波輔助熱回流技術提取馬鞭石斛多糖的方法。通過正交設計對提取溫度、時間以及提取次數進行優化，結果表明提取次數對馬鞭石斛多糖提取具有顯著的影響，優水平為A3B 2C 3，即溫度為95 ℃，時間為16 min，提取4次。經方法學考察，本方法具有良好的精密度和穩定性，且重復性好。與傳統熱回流法相比，超聲波輔助熱回流技術最大的優點就是提取時間短、效率高，大大節省了生產能耗，這一點也可以從我們的實驗結果中得到佐證。分析原因，可能正是由於超聲波的機械效應、空化效應和熱效應，增大了介質分子的運動速度和介質的穿透力，從而更好的提高了有效成分的提取效率。目前利用超聲波技術提取天然產物時，通常未結合加熱處理，直接利用超聲波自身產生的熱效應來增大提取率，但超聲波的熱效應畢竟是瞬時的，對於提取率的增加效應較弱。因此實驗在采用超聲波提取的同時，結合熱回流技術提取馬鞭石斛多糖，並對提取條件進行優化，尋找節時、節能、得率高的提取工藝，為其工業生產提供實驗依據。