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我國現有的76種石斛屬植物中,具藥用的就有40多種。其藥理主要是強陰益精、補腎益力、明目和延年益壽。霍山石斛(Dendrobium
huoshanense.CZTanget SJCheng)又名米斛,蘭科石斛屬植物,原產安徽霍山,是藥用石斛中的極品。由於石斛是一種附生植物,對生態環境要求比較嚴格,自然繁殖頻率極低(<5%),加上長期採集,野生植株已瀕臨滅絕。近年來,對藥用石斛資源進行了大量研究,特別是利用組織培養的方法對多種石斛材料進行了一定的研究,很顯然組織培養不但能挽救瀕臨滅絕的物種,而且能實現對所需求物種的快速、批量生產而滿足市場需求。但對離體條件下的遺傳穩定性和生理穩定性缺乏基礎性研究,未能獲得規範化石斛繁殖技術體系和工藝流程,從而極大的阻礙了這一名貴中草藥走向市場。本研究首次報導了霍山石斛無性快繁過程中的遺傳穩定性RAPD分析及霍山石斛的位點特異性鑑別研究結果:1.霍山石斛不同蒴果內遺傳穩定性及蒴果間的差異性:利用從20個隨機引物篩選出來的3個穩定性較好的10鹼基引物對來自五個不同蒴果的霍山石斛種群進行RAPD檢測。結果發現五個蒴果內遺傳相似係數較大,在92.5926%至100.00%之間,其中H1、H10、H9、H14存在一定程度的變異,H23是一個較為穩定的群體。五個蒴果間H1、H9、H10、H23的遺傳距離較小,H14與其它四個蒴果的則較大。說明建立霍山石斛穩定的無性快繁係是切實可行的,同時說明霍山石斛種內存在一定的變異,H14與其它蒴果的差異最大。2.霍山石斛同一蒴果內不同生長時期遺傳穩定性:利用上述3個引物對已繼代七到八次仍然維持的不同生長階段、來自同一蒴果的霍山石斛H23種群進行RAPD檢測。結果發現不同階段內遺傳相似係數較大,在85.4093%和98.3606%之間,其中在原球莖、萌芽期和一葉期存在的變異比兩葉期、開花期要顯著,但程度都極其微弱。說明來自同一蒴果的變異非常小,用組織培養的方法建立霍山石斛穩定的無性快繁係是切實可行的。3.
2,4-D、6-BA、IBA、NAA對霍山石斛試管苗分化及對其遺傳穩定性的.
霍山石斛膠囊”抗衰老及對DM大鼠降血糖作用的研究
霍山石斛(Dendrobium Huoshenese)是中藥石斛中的上品,富含石斛多醣和生物鹼等多種生物活性成分,具有益胃生津,滋陰清熱,抗衰老,提高機體免疫力等功效。本實驗在前人對霍山石斛生物活性成分研究的基礎上,對本實驗室研製的“霍山石斛膠囊”進行衛生指標、有效成分含量的測定,並進行了其對小鼠體內體外抗衰,老抗氧化等免疫機能以及對糖尿病大鼠的降血糖的研究,為“霍山石斛膠囊”的開發利用提供實驗依據。主要研究結果如下:1.由本實驗室石斛課題研究組研製的“霍山石斛膠囊”富含多醣、生物鹼等生物活性成分,其細菌、黴菌及大腸桿菌的含量均符合國家藥品衛生管理標準。2.“霍山石斛膠囊”對體外溫育和Vc-Fe~(2+)誘導的MDA的生成均有抑製作用,對Vc-Fe~(2+)羥自由基系統誘導肝線粒體的腫脹也表現出抑製作用,並在一定範圍內呈現劑量效應。3.通過“霍山石斛膠囊”對小鼠體內抗衰老的研究,表明該膠囊能明顯增加小鼠的肝臟、脾臟指數,提高血清及肝組織中SOD和CAT酶的活性,並有效降低MDA的含量,但是該膠囊對GSH-PX酶無明顯作用。4.成功地以高脂高糖飲食加註射低劑量的STZ和四氧嘧啶誘發出糖尿病(DM)大鼠模型。通過兩種方法的比較發現,STZ誘導的大鼠病情更加明顯,且穩定;而四氧嘧啶誘導的DM大鼠的病情會自身緩慢緩解,因此,以STZ誘導的DM大鼠模型更適合於研究Ⅱ型糖尿病的治療研究。5.通過以“霍山石斛膠囊”藥液對DM大鼠灌胃來研究其對糖尿病的治療作用表明,該膠囊可減少DM大鼠的飲水、飲食及排泄量,有效改善DM大鼠的“三多一少”的病症;可降低DM大鼠的血糖水準及血清甘油三脂、膽固醇及遊離脂肪酸含量(P＜0.05),調節胰島素水準;可修復胰島B細胞,改善細胞形態,增加B細胞數量,從而刺激胰島素分泌,有效調節血糖水準,對腎臟也起到顯著的保護作用。
霍山石斛類原球莖液體培養及其保健功效的研究
霍山石斛(Dendrobium Huoshanenses G.Z.Tang et S.J.Cheng)是珍稀名貴中草藥,目前已經瀕危。為採用大規模反應器生產霍山石斛替代品,實現霍山石斛資源的可持續利用,本文對液體培養霍山石斛類原球莖快速增殖和多糖合成的條件進行了研究,並對類原球莖的保健功效進行了評價。 1.液體條件下霍山石斛類原球莖最適宜的基本培養基強度是1/ 2M S;通過單因素和正交試驗,優化出類原球莖快速生長的增殖培養基是1/ 2M S+蔗糖30gL~(-1)+馬鈴薯水提液100gL~(-1)+香蕉水提液30gL~(-1)+IBA 1.0m gL~(-1),該培養基可使類原球莖在40d內增殖12.56倍。 2.葡萄糖和蔗糖對類原球莖生長與胞內多糖合成的實驗結果表明,培養基中添加蔗糖有利於多糖合成,類原球莖多糖積累的優化培養基是1/ 2M S+馬鈴薯水提液150gL~(-1)+香蕉水提液30gL~(-1)+蔗糖30gL~(-1)+,此時類原球莖的多糖含量達9.78m-/g。對多糖合成與類原球莖生長採用Pearson相關分析,結果表明,二者是負相關的,相關係數為-0.845。 3.實驗證明霍山石斛多糖具有明顯的緩解視疲勞和增強免疫低下小鼠的機體免疫功能。霍山石斛類原球莖與茶葉按照7∶3(w/w)比例配製的保健飲品,不僅可使小鼠眼球和血清SOD活力分別提高1.64倍和1.47倍,而且能有效提高免疫低下小鼠的免疫器官指數,與環磷醯胺組比較,該飲品可分別使小鼠脾臟指數提高21.6%、胸腺指數提高79%。
霍山石斛快速繁殖及其次生代謝物含量的調控研究
本文對霍山石斛的離體快繁進行系統的研究,並且對霍山石斛次生代謝物調控進行分析研究,結果如下: 1、選取MS、6-BA、KT、NAA這四個因數,每個因數3個水準,通過正交設計試驗對霍山石斛叢生芽的誘導進行研究,研究結果發現:這4個因數對霍山石斛叢生芽誘導的影響順序依次為:KT>基本培養基>6-BA>NAA,其中,KT對霍山石斛叢生芽的誘導極為顯著,而基本培養基、NAA、6-BA對霍山石斛叢生芽的誘導不顯著。並從中篩選出誘導霍山石斛叢生芽的最優培養基為: 1/ 2M S+ 0.2m g/LKT+ 0.2m g/LNAA+ 0.3m g/L6-BA。 2、以1/ 2M S+ 0.2m g/LKT+ 0.2m g/LNAA+ 0.3m g/L6-BA為基本培養基作為對照,通過附加濃度100g/L、200g/L、300g/L的土豆泥、香蕉泥、白蘿蔔汁和10mg/L、20mg/L、40mg/L的硝酸鑭進行培養。研究結果發現:不同添加物對霍山石斛生長均具有一定的促進作用,其中土豆泥和硝酸鑭的促進作用具有顯著差異性。同時,對各生理指標進行相關分析發現,可以把葉綠素含量作為霍山石斛優質苗木早期選擇的一個重要生理指標。 3、以MS為基本培養基作為對照,通過添加濃度為0.4mg/L、0.8mg/L、1.6mg/L的IBA,濃度為0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L的NAA以及品質分數為10%、20%、40%的香蕉泥進行生根培養,發現:添加20%的香蕉泥誘導霍山石斛試管苗生根效果最好。 4、以1/ 2M S+ 0.2m g/LKT+ 0.2m g/LNAA+ 0.3m g/L6-BA為基本培養基作為對照,添加濃度為0.5mg/L、2.5mg/L、12.5mg/L的L-賴氨酸、0.2mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L的水楊酸以及10mg/L、20mg/L、40mg/L的硝酸鑭進行石斛多糖的調控研究,發現: 20m g/L的硝酸鑭和2.5mg/L的L-賴氨酸在各自濃度範圍內促進石斛多糖含量的提升效果最好,且具有極顯著差異性;水楊酸則具有顯著差異性。同時,對石斛多糖清除有機自由基DPPH的能力進行初步研究,發現石斛多糖具有清除有機自有基的能力。 5、以1/ 2M S+ 0.2m g/LKT+ 0.2m g/LNAA+ 0.3m g/L6-BA為基本培養基作為對照,添加濃度為0.5mg/L、2.5mg/L、12.5mg/L的L-賴氨酸、0.2mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L的水楊酸以及10mg/L、20mg/L、40mg/L的硝酸鑭進行石斛堿和聯苄類物質Moscatilin的調控研究,利用HPLC/UV法對其進行含量測定,發現:L-賴氨酸和水楊酸對Moscatilin的含量均有一定的促進作用,且12.5mg/L的L-賴氨酸和0.5mg/L的水楊酸在各自濃度範圍的影響提升效果最好。
霍山石斛類原球莖懸浮培養細胞生長和多糖合成的動力學研究
霍山石斛是我國珍貴的藥用植物，產于安徽霍山及其鄰近地區，石斛多糖具有抗腫瘤、增強人體免疫等功效。由於霍山石斛在自然環境下生長緩慢，加上人工過度採集，其自然資源已瀕臨滅絕。目前對霍山石斛的研究主要集中在組織培養方面，但試管苗的脫瓶移栽問題尚未解決。霍山石斛類原球莖是霍山石斛的體細胞胚胎，具有和植株同樣的物質代謝和發育潛能。利用霍山石斛類原球莖懸浮培養生產活性多糖是解決霍山石斛資源短缺問題的有效途徑之一。本文對霍山石斛類原球莖懸浮培養過程進行了系統的動力學分析，並構建了動力學模型；考察了植酸和多胺對霍山石斛類原球莖細胞生長和多糖合成的影響；採用二步培養法對霍山石斛類原球莖合成多糖進行了研究；在10 L 氣升式反應器中進行了初步擴大培養。 不同培養條件下，霍山石斛類原球莖懸浮培養細胞生長曲線呈現較為典型的S型，低濃度時，蔗糖是細胞生長的限制性因素，提高蔗糖濃度可以明顯促進細胞生長，蔗糖濃度在30g ／L時，類原球莖生物量達到最大；但蔗糖濃度超過30 g ／L後對細胞生長具有抑制作用。硝酸鹽濃度為30 mmol／L時，有利於細胞生長，高濃度時對細胞生長有抑制作用。磷酸鹽是細胞生長的限制性因素，提高磷酸鹽濃度可以促進細胞生長，縮短培養週期，當磷酸鹽濃度為2.5mmol／L時，生物量達最大，為28.7g DW／L。 不同培養過程中多糖總產量變化規律相似。在一定範圍內，增加起始蔗糖濃度有利於多糖積累，但在過高蔗糖濃度下，多糖產量反而下降。硝酸鹽濃度為30mmol／L時，有利於多糖積累。初始磷酸鹽濃度對多糖的積累影響顯著，當磷酸鹽濃度為0.312 mmol／L時，多糖積累量最大為2.46g ／L。多糖合成不僅與類原球莖細胞的生長密切相關，而且與細胞內還原糖濃度有關。 霍山石斛類原球莖對培養基中蔗糖的利用採用先水解後吸收的方式，可以用帶底物抑制的酶反應動力學方程來描述該過程。類原球莖對葡萄糖和果糖的吸收沒有明顯差別，細胞內還原糖的積累與培養基的組成有密切關係，各種培養條件下類原球莖對蔗糖的得率係數也因此不同。類原球莖對磷酸鹽的吸收比較快，細胞內磷酸鹽的積累水準與培養基初始磷酸鹽濃度有關，細胞內磷酸鹽的積累水準對類原球莖細胞的生長和多糖積累有重要影響。 構建了霍山石斛類原球莖懸浮培養過程的桔構化動力學模型。模型中生物相被分為四個部分：細胞內還原糖、中間代謝產物，代謝產物多糖、細胞的呼吸損失。非生物相指細胞外部培養基，包括蔗糖和還原糖兩部分。模型的類比結果與實驗測定值基本相符，能用於霍山石斛類原球莖的懸浮培養過程預測。 在培養基中添加2.5g ／L的植酸可以抑制過氧化物酶和多酚氧化酶的活性，提高細胞活力，促進細胞生長和多糖的合成，最終生物量為29.4g DW／L，多糖產量為2.06g ／L。添加0.6mmol／L的腐胺和精氨能提高內源多胺的含量，促進霍山石斛類原球莖細胞的生長和多糖的合成，最終生物量為32.6g DW／L，多糖產量為2.20g ／L。 磷是霍山石斛類原球莖細胞生長和多糖積累的有效調控因素。可以在適合類原球莖增殖的蔗糖濃度下，調節磷酸鹽濃度，使碳源流向多糖合成。利用二步法培養，第一步培養磷酸鹽濃度為2.5 mmol／L，第二步培養磷酸鹽濃度為0.312 mmol／L，結果多糖產量和多糖含量分別為5.22g ／L和11.9％，明顯高出其他方法。建立的二步法培養模型基本反映了在二步培養中霍山石斛類原球莖增殖和多糖積累的變化規律。 進行了霍山石斛類原球莖懸浮培養的初步放大試驗，通氣量在0.5 L ／min較適宜。發酵罐中獲得的最大生物量是搖瓶的86.5％，多糖產量是搖瓶的145％。在反應器中，類原球莖細胞生長和多糖積累的動力學特性和搖瓶中相似，但發酵罐培養中各種基質消耗同搖瓶相比出現滯後現象，且利用率偏低。通過流加補料培養，生物量提高到44.7g DW／L，多糖產量提高到8.15g ／L。
霍山石斛不同繼代次數試管苗遺傳穩定性的研究
霍山石斛是安徽省的名貴中藥材,國家重點保護的名貴藥用植物,為藥用石斛中的珍品。在霍山石斛組織培養過程中,經過多代培養的試管苗是否仍然保持原有品種的遺傳性狀,關係到這一名貴中藥材的產業化。 本試驗以霍山石斛為實驗材料,分別以霍山石斛成熟種子、莖段和愈傷組織為試管苗的初始材料進行繼代培養,在分子水準上利用RAPD、ISSR、DALP、SRAP標記進行遺傳穩定性分析,旨在找出能夠使霍山石斛穩定遺傳的組織培養快繁方法,從而推動霍山石斛這一名貴中草藥的產業化。主要研究結果如下： 1.試驗採用改良的CTAB法提取霍山石斛繼代試管苗基因組DNA可用于各種分子標記方法分析,並且具有適用、成本低、簡單、省時等優點。 2.通過對反應條件的優化試驗,建立了各種分子標記方法的較適宜體系。其中,SRAP是一種新發展起來的分子標記技術,具有穩定可靠、擴增效果好、可重複性強的優點。優化的反應體系為：25μL的反應體系中,範本DNA量30ng、2.5mmol/L Mg2+濃度、0.8μmol/L的上下游引物、0.2mmol/L的dNTPs以及Taq酶1U。擴增程式為：94℃ 預變性5min, 94℃ 變性1min, 35℃ 複性1min, 72℃ 伸1min,5個迴圈, 94℃ 變性1min, 50℃ 複性1min, 72℃ 延伸1min,35個迴圈,最後72℃ 伸7min。 3.利用RAPD分子標記方法對不同繼代次數(1～4代)的霍山石斛試管苗進行分析,結果表明：引物S22對莖段誘導培養的試管苗檢測時,分別在第3、4代試管苗約1200bp處檢測出譜帶的減弱；此外,引物S22和S25對愈傷組織誘導的試管苗檢測時,分別在第4代試管苗約1200bp和500bp處檢測出譜帶的減弱。 4.利用ISSR分子標記方法對不同繼代次數(1～4代)的霍山石斛試管苗進行分析,結果表明：對愈傷組織誘導的繼代培養試管苗檢測至第4代時,引物UBC-820在大小約為2250bp處的譜帶帶型變弱,引物UBC-870在大小為1500bp處的譜帶帶型變弱；引物UBC-807對莖段誘導和愈傷組織誘導的繼代試管苗檢測時,大小為750bp的譜帶都明顯減弱。 5.利用DALP分子標記方法對不同繼代次數(1～4代)的霍山石斛試管苗進行分析,結果表明：引物組合DALP234-DALPR對愈傷組織繼代試管苗檢測時,第4代的各條譜帶明顯變弱,大小分別為2250、1500、1000、750bp;另一引物組合DALP241-DALPR對愈傷組織繼代試管苗檢測時,從第2代開始,大小約為3000bp的譜帶帶型逐漸減弱。 6.利用SRAP分子標記方法對不同繼代次數(1～4代)的霍山石斛試管苗進行分析,結果表明：對愈傷組織誘導的繼代培養試管苗檢測時,引物組合m8-em5在大小約為400bp處的各代譜帶帶型變弱。 4種分子標記所反映的霍山石斛繼代試管苗遺傳穩定性基本相同。以成熟種子為初始材料的繼代培養,其試管苗在所檢測的範圍內均未發生變異,具有高度的遺傳穩定性；以莖段和愈傷組織為材料的繼代培養,其試管苗在檢測範圍內,均能檢測到譜帶帶型的減弱,但均未探查到任何變異位點。根據這些結果,3種繼代方式比較之下,以莖段、愈傷組織為初始材料的繼代培養,在繼代過程中存在一定程度的變異,其中愈傷組織變異程度略大於莖段,以成熟種子為初始材料的繼代培養是更能穩定遺傳的試管苗快繁方式。
霍山石斛遺傳穩定性RAPD研究及位點特異性PCR鑒別
我國現有的76 種石斛屬植物中,具藥用的就有40 多種。其藥理主要是強陰益精、補腎益力、明目和延年益壽。霍山石斛(Dendrobium huoshanense.C.Z.Tanget S.J.Cheng)又名米斛,蘭科石斛屬植物,原產安徽霍山,是藥用石斛中的極品。由於石斛是一種附生植物,對生態環境要求比較嚴格,自然繁殖頻率極低(<5%),加上長期採集,野生植株已瀕臨滅絕。近年來,對藥用石斛資源進行了大量研究,特別是利用組織培養的方法對多種石斛材料進行了一定的研究,很顯然組織培養不但能挽救瀕臨滅絕的物種,而且能實現對所需求物種的快速、批量生產而滿足市場需求。但對離體條件下的遺傳穩定性和生理穩定性缺乏基礎性研究,未能獲得規範化石斛繁殖技術體系和工藝流程,從而極大的阻礙了這一名貴中草藥走向市場。本研究首次報導了霍山石斛無性快繁過程中的遺傳穩定性RAPD 分析及霍山石斛的位點特異性鑒別研究結果:1. 霍山石斛不同蒴果內遺傳穩定性及蒴果間的差異性:利用從20 個隨機引物篩選出來的3 個穩定性較好的10 堿基引物對來自五個不同蒴果的霍山石斛種群進行RAPD 檢測。結果發現五個蒴果內遺傳相似係數較大,在92.5926%至100.00%之間,其中H1、H10、H9、H14 存在一定程度的變異,H23是一個較為穩定的群體。五個蒴果間H1、H9、H10、H23 的遺傳距離較小,H14 與其他四個蒴果的則較大。說明建立霍山石斛穩定的無性快繁系是切實可行的,同時說明霍山石斛種記憶體在一定的變異,H14 與其他蒴果的差異最大。2. 霍山石斛同一蒴果內不同生長時期遺傳穩定性:利用上述3 個引物對已繼代七到八次仍然維持的不同生長階段、來自同一蒴果的霍山石斛H23 種群進行RAPD檢測。結果發現不同階段內遺傳相似係數較大,在85.4093%和98.3606%之間,其中在原球莖、萌芽期和一葉期存在的變異比兩葉期、開花期要顯著,但程度都極其微弱。說明來自同一蒴果的變異非常小,用組織培養的方法建立霍山石斛穩定的無性快繁系是切實可行的。3. 2,4-D、6-BA、IBA、NAA 對霍山石斛試管苗分化及對其遺傳是穩定的.
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