藥用植物霍山石斛之多醣體結構和生物活性本院覽號：28A-970212創作人：翁啟惠、方俊民、楊文彬智財權：美國臨時專利申請中摘要：這項發明係測定從霍山石斛的葉子、莖和黏液多醣之多醣萃取物的多醣體結構。石斛的細胞壁和黏液多醣之單醣組成和化學鍵結在此被研究並確認。具生物活性的黏液多醣萃取物之組成為2和3號位置乙醯化的葡萄甘露聚醣〈2- and 3-O-acetyl glucomannan〉。我們的研究指出，石斛的黏液多醣能在體外活化小鼠脾臟細胞產生幾種細胞色素如INF-gamma, IL-10, IL-6, IL -1a lpha, GM-CSF 和G-CSF。而經鹼液處理去除乙醯基之黏液多醣則失去刺激細胞色素產生的能力。這些石斛的黏液多醣分子量大約一萬左右，由beta-(1→4)-葡萄甘露聚醣組成，並在甘露醣上的2和3號位置上有部分的乙醯取代。黏液多醣之化學鍵結beta-(1→4)-葡萄醣和beta-(1→4)-甘露聚醣是以核磁共振光譜和酵素方法來決定。此項發明的優點：這項發明提供一個清楚的證據在研究霍山石斛之多醣體結構和生物活性之間的關係。特殊的多醣體結構對特定細胞的影響在此被確認。公共事務組聯絡人：陳淑珍 電話：02-2789-9383轉114 /石斛多醣石斛多醣具有延緩衰老、增強免疫力、抗腫瘤、降血糖等多種藥理活性。2005年版《中國藥典》收載了金釵石斛、鐵皮石斛和馬鞭石斛3種。鐵皮石斛Dendrobium candidum Wall．ex Lindl為蘭科石斛屬多年生草本植物，是我國傳統的名貴中藥材，是石斛中的極品。具有益胃生津、滋陰清熱、潤肺止咳的功效。近年來，由於過度消耗，石培養鐵皮石斛原球 莖是解決藥源不足的重要途徑。液體培養在生物量、多醣產量等方面均優於固體培養，表現在：原球莖在液體懸浮培養條件下，乾重量在50 d達到最大為17.64 g／L，多醣產量在40 d達到最大值為3 081.2 mg／L，在固體培養條件下，培養60 d乾重達到最大為13.40 g／L，多醣產量在40 d達到最大值為2 412.5 mg／L，分別比液體懸浮培養少4.24 g／L 、568.7 mg／L；從形態上看，固體培養的原球莖較綠，芽分化明顯，胚狀體弱小，液體懸浮培養的原球莖以黃色為主，稍有綠色，芽分化不明顯，胚狀體均勻、粗壯。表明通過液體懸浮培養生產鐵皮石斛原球 莖具有較好的開發應用前景[19]。對鐵皮石斛原球 莖與小菇屬真菌MF24(Mycena sp.)誘導子的相互作用進行了系統研究，獲得了真菌誘導子在鐵皮石斛原球 莖培養中的最佳工藝[20]。昆明高新五華科技園2005年開展稀藥用植物鐵皮石斛細胞培養物中多醣研究項目，每月製作和接種培養基可達8 000 L，可生產鐵皮石斛細胞400 kg。並開展鐵皮石斛細胞培養物中多醣分離、萃取及產業化研究[21]。另外，對霍山石斛Dendrobium huoshanenses GZTang et SJCheng原球莖進行了生物反應器懸浮培養研究........【摘要】： 鐵皮石斛是珍稀名貴中草藥，目前已處於瀕危狀態，為採用大規模反應器生產鐵皮石斛替代品，實現鐵皮石斛資源的可持續利用，本試驗以其原球莖為材料，比較了固體培養和液體培養的優劣，系統地探討了有利於鐵皮石斛原球 莖生長、增殖及多醣合成的最佳培養方案，並且進行了一定的滲透壓和中途補料研究，同時對比了野生鐵皮石斛與原球莖的多醣和氨基酸含量。為實現鐵皮石斛原球 莖組織培養規模生產提供參考依據，試驗結果如下：液體培養在生物量、多醣產量等方面均優於固體培養，表現在：原球莖在液體懸浮培養條件下，乾重量在50d達到最大為17.64g／L，多醣產量在40d達到最大值為3081.2mg／L，在固體培養條件下，培養60d乾重達到最大為13.40g／L，多醣產量在40d達到最大值為2412.5mg／ L，分別比液體懸浮培養少4.24g／L、568.7 mg／L；從形態上看，固體培養的原球莖較綠，芽分化明顯，胚狀體弱小，液體懸浮培養的原球莖以黃色為主，稍有綠色，芽分化不明顯，胚狀體均勻、粗壯；表明通過液體懸浮培養生產鐵皮石斛原球 莖具有較好的開發應用前景；原球莖生長與碳源、氮源和磷的消耗存在著密切關係，在培養40d，糖基本消耗完畢，表明原球莖對碳源的利用較為完全；在氮源的吸收上，NH4+優於NO_3~-，NH_4~+、NO_3~-的吸收基本上是呈直線下降；在培養30d中，磷幾乎被完全吸收。在對數生長期，電導率的下降與生物量乾重的增長存在明顯的線性關係； MS、1／2MS、B5、N6和White培養基對原球莖的生長和多醣合成有不同的差異。其中，N6培養基有利於多醣的合成，White培養基有利於原球莖生長。綜合考慮原球莖生長和多醣含量，可選擇1／2MS或N6為基本培養基。在葡萄糖，果糖，和蔗糖三種碳源中，蔗糖和葡萄糖對原球莖生長和多醣合成明顯優於果糖。綜合考慮乾重量和成本認為蔗糖是適合鐵皮石斛原球 莖懸浮培養生產多醣最好的碳源。其中以30g／L蔗糖濃度為最好；添加10％的椰汁、氮濃度為30-60 mmol／L，NO_3~-、NH_4~+的比例為40：20，30：30，光照1000 lux- 1500 lux，12h／d時，有利於原球莖生長和多醣合成；對原球莖多醣積累的影響程度依次為轉速＞pH＞接種量，最佳組合pH為5.0，搖床轉速為110r／min，接種量為50g／L，對原球莖乾重量的影響效果大小順序為pH＞轉速＞接種量，當組合為pH 7.0，搖床轉速為110r／min，接種量為30g／L或40g／L時，有利於原球莖增殖；原球莖與野生鐵皮石斛含有豐富的多醣和氨基酸，兩者含量相近；本試驗認為，最適鐵皮石斛原球 莖增殖和多醣合成的培養方案為：1／2MS+ 30g／L蔗糖+ 0.1m g／LNAA+10％椰汁，調整氮濃度為30-60 mmol／L，NO_3~-。、NH_4~+的比例為40：20，30：30，pH 7.0，搖床轉速為110r／min，接種量為30g／L或40g／L，光照1000 lux-1500 lux，12h／d。鐵皮石斛是珍稀名貴中草藥，目前已處於瀕危狀態，為採用大規模反應器生產鐵皮石斛替代品，實現鐵皮石斛資源的可持續利用，本試驗以其原球莖為材料，比較了固體培養和液體培養的優劣，系統地探討了有利於鐵皮石斛原球莖生長、增殖及多糖合成的最佳培養方案，並且進行了一定的滲透壓和中途補料研究，同時對比了野生鐵皮石斛與原球莖的多糖和氨基酸含量。為實現鐵皮石斛原球莖組織培養規模生產提供參考依據，試驗結果如下： 液體培養在生物量、多糖產量等方面均優於固體培養，表現在：原球莖在液體懸浮培養條件下，幹重量在50d達到最大為17.64g／L，多糖產量在40d達到最大值為3081.2mg／L，在固體培養條件下，培養60d幹重達到最大為13.40g／L，多糖產量在40d達到最大值為2412.5mg／L，分別比液體懸浮培養少4.24g／L、568.7 mg／L；從形態上看，固體培養的原球莖較綠，芽分化明顯，胚狀體弱小，液體懸浮培養的原球莖以黃色為主，稍有綠色，芽分化不明顯，胚狀體均勻、粗壯；表明通過液體懸浮培養生產鐵皮石斛原球莖具有較好的開發應用前景； 原球莖生長與碳源、氮源和磷的消耗存在著密切關係，在培養40d，糖基本消耗完畢，表明原球莖對碳源的利用較為完全；在氮源的吸收上，NH4+優於NO_3~-，NH_4~+、NO_3~-的吸收基本上是呈直線下降；在培養30d中，磷幾乎被完全吸收。在對數生長期，電導率的下降與生物量幹重的增長存在明顯的線性關係； MS、1／2MS、B5、N6和White培養基對原球莖的生長和多糖合成有不同的差異。其中，N6培養基有利於多糖的合成，White培養基有利於原球莖生長。綜合考慮原球莖生長和多糖含量，可選擇1／2MS或N6為基本培養基。 在葡萄糖，果糖，和蔗糖三種碳源中，蔗糖和葡萄糖對原球莖生長和多糖合成明顯優於果糖。綜合考慮幹重量和成本認為蔗糖是適合鐵皮石斛原球莖懸浮培養生產多糖最好的碳源。其中以30g／L蔗糖濃度為最好； 添加10％的椰汁、氮濃度為30-60 mmol／L，NO_3~-、NH_4~+的比例為40：20，30：30，光照1000 lux-1500 lux，12h／d時，有利於原球莖生長和多糖合成；對原球莖多糖積累的影響程度依次為轉速＞pH＞接種量，最佳組合pH為5.0，搖床轉速為110r／min，接種量為50g／L，對原球莖幹重量的影響效果大小順序為pH＞轉速＞接種量，當組合為pH 7.0，搖床轉速為110r／min，接種量為30g／L或40g／L時，有利於原球莖增殖； 原球莖與野生鐵皮石斛含有豐富的多糖和氨基酸，兩者含量相近； 本試驗認為，最適鐵皮石斛原球莖增殖和多糖合成的培養方案為：1／2MS+ 30g／L蔗糖+ 0.1m g／LNAA+10％椰汁，調整氮濃度為30-60 mmol／L，NO_3~-。、NH_4~+的比例為40：20，30：30，pH 7.0，搖床轉速為110r／min，接種量為30g／L或40g／L，光照1000 lux-1500 lux，12h／d。目的研究鐵皮石斛Dendrobium candidum原球莖液體懸浮培養的可行性以及接種量和培養液體積對原球莖生長的影響.方法利用完全隨機實驗設計和正交試驗設計研究不同基本培養基、接種量和培養液體積對原球莖生長的影響.結果無論鮮重還是乾重,鐵皮石斛原球莖在液體培養基上均極顯著好於固體培養基(P＜0.001).不同基本培養基對鐵皮石斛原球莖生長影響的研究表明,培養天數為30 d時,對於鮮重:67-V極顯著好於B5(P＜0.01),B5極顯著好於1/2 MS(P＜0.01),1/ 2 M S顯著好於MS(P＜0.05);對於乾重:67-V與B5沒有顯著性差異(P＞0.05),B5極顯著好於1/2 MS(P＜0.01),1/ 2 M S極顯著好於MS (P＜0.01).接種量和培養液體積對原球莖生長影響的研究表明,接種量影響最大,體積其次,互作最小,若不考慮互作,對於鮮重和乾重,最佳處理為:接種量6.194 g/瓶+培養液體積150 mL/瓶或100 mL/瓶;對於乾重,若考慮互作,接種量為6.194 g/瓶時,應選培養液體積150 mL/瓶或100 mL/瓶,接種量為3.102 g/瓶時,應選培養液體積150 mL/瓶或100 mL/瓶,接種量為1.693 g/瓶時,應選150 mL/瓶或50 mL/瓶.結論液體懸浮培養對鐵皮石斛原球莖的生長有利,獲得了最佳基本培養基、接種量和培養液體積的最佳搭配方案,表明通過液體懸浮培養生產鐵皮石斛原球莖具有較好的開發應用前景.
