天山雪蓮
---------------科學使上帝更親近人類,並使人類更相信上帝---------------------------
生物技術在動物種原保存之應用
生科所教授、國科會南科籌備處主任戴謙
一、前言
美國技術評估局(U.S.Office of TechnoIogy Assessment)把生物多樣性定義為「生物體
之間的多變 性與歧異性，與其所產生之生態上的複雜環境」(the variety and variabiIity
among living organisms and the ecological complexes in which they occur)。由這個定義看來
，它包含了"種原變異(species diversity)","遺傳變異(genetic diversity)"及"群落變異(
communitydiversity)"等三個層次。種原變異 代表該一種原的整個進化及對生態環境適應
的 過程，此種變異性提供了人類對資源的選擇機 會;遺傳變異則提供了該一種原維持生
殖力及抗病力和適應環境變化所必須的能力;群落變異為該一種原對各種不同環境條件
的總和反應。
在過去的數百年來，所有的物種均隨著地球環境的變遷來調整自己的各項形值
(Characteristics)，以適應其所在的棲息地。此種適應性的結果，造就了現今全球的生物
多樣性。然而隨著人類為了改善生活及追求經濟發展，因而導致了區域或全球性不可
恢復的破壞，造成了物種的遺傳侵蝕(genetic erosion)，而使基因的多樣性損失。因此在
環境惡質污染及生物多樣性的快速流失之下，人類將陷於萬劫不復的窘境裡。
生物技術是二十一世紀明星產業的科技基礎，過去二十年來研發成果進展神速。
今(2000)年6月26日由美國柯林頓總統及英國首相布萊爾共同宣布並恭賀跨國合作之人
類基因組計畫(Human Genome project,HGP)及Celera Genomics公司完 成了人類基因組織
DNA序列工作草稿(working draft)。此一生物科技成果將為人類健康及人類福祉帶來革
命性的成果，與登陸月球及原子彈研發共列為本世紀三項人類最偉大的成就。因此在
舉世關心生物多樣性的時代中，利用生物科技研發成果來協助全球生物多樣性的評估
及維註是今後永續經管全球生物多樣性的重要課題。
我國在家畜禽生殖細胞處理技術及基因轉殖應用之研究已有一些具體的成果，利
用這些成果在動物生物多樣性保存上，將對我國種原保存及稀有動物的復育具有重大
貢獻，故本文擬就現有國內生殖技術現況及國際情形做一簡要介紹，並就目前亞洲利
用生物技術來復育保育動物之案例作些說明。
二、生殖科技之應用
家畜的繁殖技術已進入胚工程時代。藉由胚操技術，可以有效提高家畜之繁殖率
，培育出具有優良性之畜群而改善生產效率。生殖科技可就精子與胚操作來說明，在
家畜禽精液冷凍保存與人工授精方面，本省乳牛以人工授精配種的比例高達95%以上
，推廣相當成功。而羊人工授精技術已開發成功，目前正擴大推廣田間應用。家禽之
冷凍精液研究，畜試所曾進行北京鴨與正番鴨精液冷凍保存與-195"C之液態氮的研究
，此技術有助於保種家禽基因之長期保存並節省公禽飼養費用(戴，1993)。在家畜胚
操作相關技術茲分述如下:
I﹒家畜胚移置及其相關科技研究:(請參見圖1)
(i)胚移置:
乳牛為懷孕期長之單胚動物，以傳統方法進行牛群改良並擴大牛群頭數需時
甚長，胚移置技術的應用則能在短時間內使性能優良的母畜大且繁殖後代而縮短
世代間距，已成為牛群性能改良之重要技術。其方法是將性能優良之高產乳牛，
經過超級排卵與同期發情處理後，以非外科法採胚並將之移置入受胚母牛之子宮
，在短期問內獲得數量較多的優良仔牛，加速牛群的改良。我國在乳牛胚移置之
試驗已歷時多年，目前在冷凍胚與新鮮胚移置之成功率已達近45%，並推廣至田
間應用，對於提升乳牛之產乳量與改善乳品貿具有相當程度的 意義(李等，1993)
。同時胚移置技術可借用性能較差的母牛，來生產高價值的牛種如日本和牛，供
生產高級牛肉之用亦具經濟憤值。由於胚移置技術較人工授精技術更為複雜，將
來的重點除了訓練更多熟練操作胚移置的技術人員外，嚴謹的胚移置操作以避免
疾病的傳播，並建立全國性的牛胚移置服務網，將此技術作全面性的推廣，對酪
農事業將有莫大的助益。除了乳牛胚移置外，其他動物如山羊、豬與綿羊的胚移
置技術也成功應用在各種試驗中，這些動物體型較小，無法如牛一般使用非外科
手術法採胚，仍須仰賴外科或半外科方法進行。
(ii)胚冷凍保存與分割技術:
胚冷凍技術，可將採集的多餘胚置於液態氮中永久保存，俟有適當之受胚牛
或進行相關試驗時再予與解凍使用。在本省，胚冷凍技術已應用在本地土種家畜
禽的種源及優良種母畜遺傳物質保存，種源之保存與建立是目前國際間最熱門之
研究課題，可做為國際間種源或品種交流。各種動物的胚保存於-l96℃液態氮中
，解凍後移置，在乳牛與山羊等動物以獲得成功的產仔。家畜早期胚分割是採取
授精後第6-7日之桑椹或囊胚期之胚，在顯微鏡下將胚分切為二，再移置入受胚母
牛子宮使分娩同卵雙胞胎動物，建立同卵雙之動物生殖模式。結合生殖細胞冷凍
和體外授精技術，可促使家畜的品種改良更企業化和國際化。若代替活畜出口，
極有利於運輸及國際間遺傳資源之交換。
II生殖細胞之操作:
自屠宰場取得家畜的卵巢，取出未成熟的牛卵與豬卵進行體外培養、體外授
精與體外成熟，是一系列胚操作工程的重要技術，也是將來胚選殖 (cloning)的重
要基礎，對於世代間距長的家畜尤其重要(Playne, 1994 ; Seamark, 1994)。目前，
我國在豬與牛等大動物生殖細胞的體外操作技術上已建 立良好的模式。純熟的生
殖細胞體外操作技術，能大量獲得良好可用的受精卵，供生殖及進行基因轉置動
物之研究，經濟價值甚高。配合胚冷凍技術、胚移置與性別鑑定，使胚得以量產
並成為運輸方便的高價值商品。而胚細胞和轉置的研究，由單一胚即可製作同卵
多生的複製個體。在國外，利用體外培養、選殖與胚性別鑑定等技術，在綿羊、
乳牛、豬與兔子已進行核移置試驗(First,1990)。
III﹒胚幹細胞株之研究:
胚幹細胞的建立，可供基因表現與調節、發生學與腫瘤學研究之用。胚幹細
胞株的建立是使早期胚中有充分分化能力的細胞進行分裂而不分化。目前，胚幹
細胞株僅小鼠、大鼠及豬有成功報告，其他動物者則僅建立「類」胚幹細胞株。
養豬科學研究所已成功建立小鼠之胚幹細胞株、嵌合小鼠及十個以上的豬類胚幹
細胞株(中華民國農業科技研究成果，1996)。畜試所則利用取自懷孕期之胎豬與
鼠胎，做為成緞維細胞培養的材料，建立一個杜洛克 種豬及五個ICR品系小鼠胎
兒成纖維細胞株，並應用在哺乳動物胚幹細胞之體外培養試驗中(Chen eta1.,1991)
。在國外，利用顯微注射與電穿孔處理胚幹細胞，生產特定基因剔除(knockout)的
突變動物，對於動物生長與分化過程中一些重要生長分化因子的研究室頗為重要
的工具。
IV.複製技術之研究
將已分化之體細胞予以"飢餓"培養之後，讓它恢復全能性，在利用細胞核轉置
技術，經由電融合的刺激，已順利的可以複製高等動物(請參見圖２)。英國Roslin
研究所將取自綿羊之乳腺細胞以生物技術複製出一頭綿羊"桃莉" (Wilmutetal. ，
1997)，此種不經有性生殖而能大量增殖同一個體的技術，使科學家掌握前所未有
的能力來改變生命，對全球也造成了極大的震撼。在此同時，美國複製猿猴與乳牛
，紐西蘭複製綿羊等利用先進生殖技術的成功，使科學家們在未來能夠隨心所欲的
複製猶如藥用蛋白賀生產工廠的基因轉殖羊，進而生產人 類所需之高價值醫藥產
品，或改善家畜禽的各種生產性狀，使畜牧生產邁向新的分子牧場領域，創造難
以估計的經濟利益。
三、基因轉殖動物之研究
近年來，分子生物發現基因可以在生物種間相互移植重組，可將期望之基因插入
家畜之基因組中生產基因殖動物，生產高價值的蛋白產物(Pursel and Rexroad , 1993 ;
Wilmut and Whitelaw， 1994)。在外國，包括小鼠、綿羊、乳牛、豬、雞、魚與兔子等
均有轉殖基因的胚或後代產生。基因轉殖動物之生產，主要是將選殖之外源基因嵌入
動物之染色體內，期能改進動物之性能表現，強化健康及生產人用之生物醫藥
(Houdebinem , 1995 ; Peel , l996 ; Ward and Nancarrow ,1995)。利用基因轉殖動物之乳腺
分泌高價值藥用蛋白的優點，是其與人體製造的蛋白有非常相似的生化結構與功能，
純化相當容易，比細胞培養法降低千倍的生產成本"。外源基因的導入可以修飾乳汁組
成，故有將牛的α-乳白蛋白(BIeck and Bremel , 1994)與κ-酪蛋白基因轉殖至小鼠胚中
生產基因轉殖小鼠的研究，其乳腺可以表現外源基因。由於κ-酪蛋白是乳蛋白的重要
組成之一，對牛乳形成微粒(micelle)的大小與功能十分重要，影響乳汁諸多物理特性。
κ-酪蛋白基因轉殖小鼠分泌的乳汁有明顯較小的微粒，因此，基因轉殖技術可應用在
增加或調整κ-酪蛋白與鈣敏感性酪蛋白的比例，改變乳汁的物理加工特性(Gutierrez
etal.,1996)。而將小鼠之內源性α-乳白蛋白刪除後，以人乳同原之α-乳白蛋白基因轉
置，以此基因轉殖小鼠來研究乳汁合成的分子機制(Colman,1996)。
目前，國內在基因轉殖動物之相關研究，養豬科學研究所為解決仔豬下痢及貧血
問題，希望能培育帶有乳鐵蛋白基因之基因轉殖豬，提高仔豬隻育成率。目前已完成
豬乳鐵蛋白互補核酸基因庫核酸定序、限制脢固譜分析與乳鐵蛋白分析法。選殖之豬
乳鐵蛋白基因接上小鼠乳清酸蛋白啟動子進行小鼠胚之顯微注射，已有基因轉殖小鼠
出生，未來期能生產帶有乳鐵蛋白基因的轉殖豬品系。
最近，豬研所已成功獲得帶有人類MHC基因的基因轉殖豬，此一成果對未來利用
豬來供應人類所需的器官，或減少移置時的排斥現象提供一具有潛力的希望。由於基
因轉殖動物也能應用在醫學及生物學範圍，包括腫瘤、心臟血管、各個臟器之發 炎與
免疫疾病，早期腫瘤遺傳學與毒物學的研究，以之做為人類疾病的研究時在相當重要
。中興大學畜產系已完成山羊β-酪蛋白基因之選殖(Huang and Lin.，1996)、定序與基
因構築(趙及黃，1997)，其啟動子接上可以生產高價值蛋白質之結構基因如乳鐵蛋白
基因等，可應用在基因轉殖動物之研究。此外，含硫蛋白基因(metallothioneine)之啟動
子，可經由飼料或飲水中添加適量的重金屬而誘導 其連結之結構基因表現供基因轉殖
用。供基因轉殖用之外源基因，主要是改進家畜生長、生殖、抗病、修飾禽畜產品組
成或生產可供人類醫療用途之高價值蛋白質如凝血第九因子(杜等，1995 ; Clark et al.,
1989)或造紅血球因子等(Velander et al.,1992，1997)。基因轉殖動物之最終目標，是期
望能由泌乳 期長且產乳量高的大型家畜如豬、綿羊、山羊或乳牛的乳房將轉殖基因的
蛋白質分泌在乳汁中(Mullins and Mullins , 1996 ; Wright et al., 1991)。
目前，生產基因轉殖動物最普遍應用的方法是顯微注射法，雖然此法的效率不高
且基因難以定位插入，大型家畜如牛與豬等之基因轉殖效率均低於1%，但仍較其他的
方法可行。在國外，將生長素基因以顯微注射法注入胚中，生產的基因轉殖豬能表現
外源之生長素基因，達到肉質改良的效果，然亦存在關節炎、不孕或分娩後早期死亡
等副作用，此可能與基因過度表現有關(Pursel et al., 1989)。國內在基因轉殖動物之研
究上，多數是利用顯微注射進行各種基因轉殖動物之研究。除了顯微注射法外，有部
分的相關研究則利用反轉錄病毒法、精子媒介法與電孔處理等方法(陳等，1995 ; 鄭及
陳，1995 ; 吳及黃，1996)，探討能否提高基因轉殖效率，供基因轉殖動物之生產。未
來應著重於基因表現調控的瞭解，使特定基因在特定發育階段或特定組織表現。另外
，如何提高轉殖基因的表現量，並選殖出其他調控動物生長與發育的重要基因也是
未來發展的重要趨勢。省畜產試驗所為了保種目的，利用顯微操作與電融合技術進行
小耳豬之核轉置，產生具有小耳豬細胞核及藍瑞斯細胞質的核轉置複製豬(Chen et al.,
l992a,b)。
四、稀有動物的復育
日本鹿兒島大學農學院教授後藤和文利用經由處理死亡的牛精子，經過冷凍數個
月之後，再將該等精子藉顯微注射(microinjection)技術強制注入母牛的卵細胞中，逾
1989年成功地獲得受精卵，並逾1990年順利的產下了正常的小牛來。此一結果證明死
亡精子的基因也能得到受精卵。本項成果在1992年國際胚移置學會年會發表後，即獲
得日本宮琦市貿易公司經營者小村一年先生的協助，擬利用該一技術推動猛瑪象的復
育工作。猛瑪象為絕種動物，至目前日本與俄羅斯科學院的合作中，只找到猛瑪象的
骨盤及獠牙，完整的大象則尚未發現，亦即尚未尋得可用之精液。若猛瑪象的精液(由
冷藏在極區之雄猛瑪象體內)取得之後，即可利用前面提到過的一些生殖技術，進行
復育的工作。其過程江晃榮先生於科學月刊中已有過論述，謹將其實驗流程
摘錄於圖３。
環顧亞洲國家中，有一些瀕臨絕種的動物，其中哺乳類以貓熊(Giant Pandas)最為
家喻戶曉，世界現存數目約為800-1000頭，主要由於牠的自然配種困難、受精率低、
受孕率差、假懷孕及胎兒生長緩慢等原因，導致族群無法擴大。在鳥類方面，於日本
及中國大陸棲息的朱鷺(Crestedlbis)也瀕臨絕種，目前在中國陝西省僅存不到200隻，
而日本則有6隻。目前這兩種動物均有跨國際化在推動復育的工作，藉著這些實際案
例的努力，透過最新開發的生物科技，希望為世界建立可行的模式。
五、未來展望
野生動物的保育因為較能引起社會大眾的同情而容易獲得支援，至於家畜禽的種
原由於商業競爭下，正快速的被淘汰中，包括一些稀有的傳統家畜品種在內，一直到
最近才較受重視。因此，家畜禽之專業化保種工作的歷史並不算久。幸運的是，動物
育種者已能夠將一些傳統品種加以保存，並且在過去十年來，大家也都普遍意誠到家
畜禽保種的重要性，願意不計利潤針對非商業化品種進行種原保存的育種者越來越多
，而且近來更因為要成立一個全球性的稀有品種保存機構，而使一些國家更積極地進
行家畜禽的遺傳資源保存。
為了減少商業品種的大量擴增而傷宮到現有遺傳資源，目前科學家們也都能應用
現代科技來進行保種，包括分子遺傳層面的篩選、動物種原保存方面的開發、胚胎銀
行及動物基因銀行的設立。
雖然上述的各項技術大都集中在家畜禽生殖技術方面，但一些技術也能應用到一
些瀕臨絕種的動物品種上。尤其是一些與動物複製、核轉置、生殖細胞的體外保存(
包括精子、卵及胚胎)、germ cell的冷凍保存等。
這些冷凍保存的技術中，玻璃化法(vitrification) 冷凍保存是將來進行動物遺傳資
源保存最具潛力的一種方法，而且這些方法同樣可以延伸到野生動物的保種上，尤其
是在某些意外死亡發生時，野生動物的細胞及組織要如何移植到家畜禽品種上而得以
保存下來，值得更進一步開發研究。一些可供複製用的細胞或組織應長期保存於液態
氮(-196℃)下，一直到複製野生動物的方法建立之後再來利用。
另一項重要的研究方向就是如何自早期胚胎中取得體細胞或生殖細胞來建立胚幹
細胞(embryonicstem cell)的細胞系，但此項試驗在進行之前，應累積更多的基礎資料，
以免浪費人力進行盲目的嘗試。
參考文獻摘要:
1.江晃榮，1999。長毛猛瑪象要復活了!科學月刊， 30:850-859。
2.楊惠郎，蕭振文，戴謙，宋永義，1998。生物科技在畜產上之應用。畜產研究，31:197．210。
3.Wilmut, L., A. E﹒Schnieke, J. McWhir , A. J. Kind and K. H. Campbell，1997。Viable offspring derived
from fetal and adult mammalian cells. Nature 385:810-813。
奶山羊轉基因供核細胞的再饑餓對核移植胚胎發育的影響*
摘要 爲提高轉基因奶山羊體細胞核移植胚胎早期發育率，將經轉染外源基因的山羊胎兒成纖維細胞經饑餓培養（含0.5%FCS的DMEM）5天後分成兩部分：第一部分細胞－80℃或液氮凍存，試驗前復蘇後直接用作供核細胞（試驗組Ⅰ），或復蘇後恢復培養（含10% FCS的DMEM）2－5天後再饑餓5天用作供核細胞（試驗組Ⅱ）；第二部分細胞作傳代培養（含10% FCS的DMEM）2天後再饑餓5天用作供核細胞（試驗組Ⅲ）。將上述不同處理的供核細胞進行細胞周期與存活率的檢測，並將該供核細胞移入去除遺傳物質的山羊MⅡ期卵母細胞的卵周隙內，經電融合、化學啟動後，將核移植（NT）胚胎經0.8%瓊脂糖包理後移入臨時寄母輸卵管內，培養6天後回收並觀察NT胚胎的早期發育。結果，試驗組Ⅱ所用供核細胞中G0/G1期細胞所占比例及其存活率分別爲95.68%、99.9%，均顯著地高於試驗組Ⅰ（88.66%、80%）；試驗組Ⅱ的桑椹及囊胚期NT胚胎的發育率（66.09%）顯著地高於試驗組Ⅰ（22.00%）與試驗組Ⅲ（50.51%）。將以上發育的NT胚胎分別移入同步發情的受體後，35天作B超妊娠診斷，試驗組Ⅱ的受體妊娠率爲45.83%，顯著地高於試驗組Ⅰ（20.00%）與試驗組Ⅲ（29.58%）。流式細胞儀分析結果表明，饑餓後的供核細胞經冷凍，復蘇後恢復培養2－5天，再經饑餓處理，能顯著地提高G0/G1期細胞的比例及細胞存活率；應用該細胞所組建的NT胚不僅具有較高的桑椹與囊胚期發育率，而且具有較高的受體妊娠率。
關鍵字：核移植 饑餓 轉基因細胞 胚胎發育 冷凍
SM22a參與血清饑餓誘導的血管平滑肌細胞微絲重塑
程雲會 韓 梅* 溫進坤
(河北醫科大學基礎醫學研究所，河北省醫學生物技術重點實驗室，石家莊050017)
摘要： 血清饑餓可誘導體外培養的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)由合成型轉變爲收縮型，微絲重塑是該過程的一個重要事件。平滑肌22 a(smooth muscle 22 alpha, SM22a)是VSMC的標誌蛋白，爲了證實SM22a是否參與調節VSMC的微絲重塑過程，採用反義 技術，封閉SM22a表達，利用間接免疫熒光染色、透射電鏡觀察SM22 a表達對VSMC微絲重塑的影響，利用細胞平面遷移實驗觀察SM22 a表達對VSMC運動功能的影響。實驗結果顯示，在血清饑餓培養的VSMC中，伴隨著SM22 a和SM a肌動蛋白表達上調，微絲數量明顯增多，呈極性束狀分佈。用反義SM22 a抑制SM22a表達後，血清饑餓誘導的VSMC微絲重塑受阻，微絲纖 細，排列紊亂，且細胞遷移活性下降。結果提示，在VSMC微絲組裝過程中，SM22 a可能起一種捆綁蛋白作用。
關鍵字： 血管平滑肌細胞；平滑肌22a；微絲重塑；遷移
供體細胞培養處理方法對水牛核移植效果的影響
Development of Buffalo Nuclear Transfer Embryos Derived from Donors Cultured in Different Ways
楊素芳 石德順 馮貴雪 韋精衛 韋英明 陸鳳花
摘 要：以經常規培養法(DMEM+10%FCS)、血清饑餓法(DMEM+0.5%FCS培養5～10 d)和Apidicolin-APD結合血清饑餓法(0.1 mg/LAPD培養24 h,DMEM+0.5%FCS培養1～18 d)培養處理的水牛卵巢顆粒細胞和水牛成體耳部成纖維細胞作供核,分別採取帶下注核法和胞質內注核法進行核移植.同一供核細胞各處理組間的核移植胚融合率(以顆粒細胞作供核)以及重組胚的囊胚發育率無明顯差異(P＞0.05),但經APD+0.5%FCS培養處理供體細胞核移植後的分裂率顯著高於其他組(P＜0.05).用7%乙醇處理的成體耳部成纖維細胞進行核移植,其重組胚的分裂率和囊胚發育率與對照組(不含乙醇)均無明顯差異(P＞0.05).結果表明,(1)血清饑餓處理水牛供體細胞對其核移植效果沒有影響;(2)DNA合成抑制劑APD結合血清饑餓培養處理水牛顆粒細胞和成體耳部成纖維細胞,可提高其核移植效果;(3)乙醇顧啟動處理水牛成體耳部成纖維細胞,對其核移植效果沒有影響.
關鍵字：水牛卵母細胞;核移植:顆粒細胞:成體耳部成纖維細胞;血清饑餓;APD;乙醇;預啟動
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