1 操作室無菌管理條件.
2 分生變異因素的防制.
3 配方與瓶苗生態關係.
4 無病毒株生產與管理.
5 溫度與PHAL.絕對關係.
6 植株建立生長習性條件制度.
.....................TTC 12.5
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| 2007組培苗量產技術訓練研習班講義 |
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| 2007組培苗量產技術訓練研習班講義 |
台灣組織培養苗之量產問題
中興大學 陳加忠
組培苗生產三項要求：在一定的時間，生產一定的數量，維持相同的品質。
而在此生產過程中，物料、能源的消耗儘量最低，人工的使用儘量最少。空間的安排最為合適。為了達到此目標，組培苗量產基本條件如下：
1. 種源的穩定性：不變異，無病毒。
2. 生產環境的一致性：包括組培瓶內氣體環境與根部環境之一致性。
3. 作業流程之合理化：包括物料輸送、人員管理、空間應用等。
國內量產作業的問題：
1. 預定生產的數量無法如期完成。
2. 生產之組培苗品質比先前少量生產時較低。
3. 生產之品質整齊性不一致。
4. 單位植株之生產成本反而增加。
面臨的問題來源：
1. 硬體設備之性能調整
2. 生產環境之一致性、均勻性
3.管理作業之合理
量產設備之常見問題
培養基之混合作業
培養基之均勻性可以採用pH值、黏度、與比重量測方式加以檢定。由混合桶內上、中、下各位置抽樣量測加以比較。
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培養基分注作業
量產的主要的問題在於分注量是否一致。
分注量均勻性檢定可使用精密天平量測分注量，再以品質管制原理加以檢定。
三-1、殺菌爐之溫度分佈
培養基在分注於組培瓶之後，即送入高壓殺菌爐中進行滅菌作業，若採用已殺菌完成之組培瓶，則可省略此流程。
國內殺菌作業主要面臨之問題在於殺菌作業不完全，造成了污染問題。在生產規模小時，小型殺菌爐之殺菌作業空間以圓柱形為主，高壓高溫之蒸氣分佈均勻，不易產生死角。大規模殺菌爐以長方型空間為主，因組培瓶充塞內部，高壓蒸氣不容易分佈至各角落，必需妥善規劃蒸氣出口位置與壓力，才能使蒸氣均勻分佈所有部份，達到殺菌目的。
大型高壓殺菌爐另一個問題在於溫度感測器之放置位置與感測性能。溫度感測器不準確或取樣溫度不適當，則無法反應真實溫度，對蒸氣量之控制也不能完備。
殺菌爐內溫度均勻性可以採用多點溫度計配合數據記錄器(Data logger)加以檢查。
栽培室之環境問題
栽培室之清潔性
由空氣內微生物之量測與鑑定可以瞭解栽培室之空氣清潔能力與組培場附近環境分佈之微生物。例如台中縣新社鄉境內之組培場其雜菌污染源以菇類真菌為主。在以紫外光線長期殺菌的組培室，璊類成為主要之污染源。
目前利用空氣孢子收集器加以改裝，可用於收集栽培室內微生物，再用以鑑定。此技術也可應用於操作台空氣清潔性之檢定。
栽培室溫度均勻性
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栽培室之空調設備來自工業的空調冷凍界，而通常進行空調的房間內部實體占用的比例不高，因此空氣容易流通。在栽培室中栽培架占滿了空間，栽培架上各層又放置成排成列組培瓶，栽培室空氣流動不如一般辨公室之順暢。在此種空間利用方式下如何使栽培室內溫度均勻，相關之空調技術在於冷氣進風口與出風口位置，還有冷風導流的方向。國內大型組培場之栽培室內，其各點溫度差異性有±3.5℃ 之記錄。
三、栽培架上各組培瓶之光量分佈
組培瓶放在組培架上，能夠接收的光量受到架上所用燈管的數量、高度、排列角度與組培瓶的相對位置等因子所影響。組培瓶之排列方式，本身材料的反射率為條件也影響了受光量，要得到均勻之光量上述因子都必須加以考慮。
組培瓶之物性量測
組培場中最關鍵之設備就是組培瓶。組培瓶在量產之前必需瞭解以下的物性。
換氣率
二. 分光透光率
三. 機械強度
一.換氣率
換氣率代表組培瓶內外空氣每小時交換的體積。換氣率愈大：
1.組培瓶內CO2與相對濕度對外界交換量愈大，
2.乙烯對外界交換量愈大，有利小苗成長
3.容易造成培養基脫水硬化，不利根系發展。
4.容易造成微生物污染
歐美組織培養瓶其換氣率為每小時交換0.3~0.4倍之組培瓶體積。
分光透光率
組培瓶分光透光愈均勻，植株之成長愈容易掌握。在藍光區透過率不足時，
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不利組培苗芽(shoot)之生長。在紅光區透光率不足時。不利根系生長。
三.溫度分佈梯度
組培瓶內溫度分佈有梯度現象。接近瓶蓋上方之空間溫度最高，培養基之溫度受到承盤，組培架之承架材料與結構，光源強度等因子所影響。
四.相對濕度分佈梯度
理想的組培瓶內微氣候在接近瓶蓋上方之空間維持較低的相對濕度可以使得此部份空間的微氣候蒸氣壓差增大，因而促近植株之蒸散作用。
組培苗生長之環境調節
在組培苗生長時期，傳統上不重視環境調節。以教科書說法為例：
溫度：有恒溫25℃ ，或是日溫25℃/夜溫20℃ 。
光量：自25至250umol/m2sec。
光周期：通常採取12小時明期，12小時暗期。也有16hr/8hr 或是8hr/16hr。
日本提倡的技術: 高濃度CO2之補充
問題：為什麼需要補充二氧化碳？
1.無糖栽培時，空氣內之CO2為唯一碳源。
2.組培瓶內CO2在光周期迅速用完。
討論：
1. 高CO2濃度是否有益蘭花組培苗？
2. 組培瓶內CO2在明期是否用完？（到達CO2補償點）
3. 蝴蝶蘭組培苗光合作用能力是否足夠高？
組培苗生長之環境調節
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以組培瓶內微氣候測定，建立作物光合作用與呼吸作用模式。由此可測試組培苗在不同環境下淨光合作用速率。
1. 比較在相同處理下，不同品種之植株其光合作用速率之不同，以決定那一個品種有最高之淨光合作用速率，做為選種、育種之基礎。
2. 決定在相同品種、相同環境下，何種成份之培養基最適合此作物。
3. 決定在相同品種、相同培養基條件下，組培苗成長的最佳溫度、光量與光週期。做為栽培室環境控制之依據。
降低組培苗產業生產成本
特點：園藝產業中人力比例最高
解決方式：
一、移至工資低廉的國家
問題：1.該地技術水準能否勝任？
2.關鍵技術是否外移？
二、機械人，機械手臂，自動化
問題：1.由於組培苗之生物特性與 變異性，組培苗用機械
手臂比工業產品更複雜，更昂貴。
2.組培苗生產之數量，單位植株之成本。
學術研究:
1. 1993年 : 歐洲結束
2. 2000年 : 日本結束
3. 1999-2003 : 台灣持續研究中
三、作業方式更低廉，更有效率
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1. 單位人力之產值更高
2. 作業系統流程更簡化
3. 改善栽培環境，縮短繁殖周期
以色列組培產業量產經驗
1. 生產場：Rahan Meristem
2. 組培設備公司：Osmotek Ltd.
主力產品：香蕉、橄攬、乾棗
特點：縮短幼年期
生產線：黎巴嫩人，工資低，生產場在邊境
組培苗：60﹪外銷，40﹪本國使用
Osmotek Ltd.
1.省力化，低成本設備
A. 液體培養基
1. Life Reactor System
Ebb ＆ Flow reactor
2. Floats ＆ Rafts
3. Vitroseal
4. Vitrocut
5. 方型組培瓶，透氣膜
I：高人力成本地區
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1. 以機械化作業降低成本
2. 利用液體培養基與通風控制以促進成長速率，增加繁殖倍率
3. 控制污染以減低總成本
4. 減少洋菜量（agar）
5. 使用低成本之栽培室: 完全密封組培瓶
II：低人力成本因素
1.分切作業機械化，減少操作錯誤
2.使用完全氣密容器，配合pH調節以減少污染
3.使用一般栽培室，空氣清潔室要求不嚴格
III：適用作物: 1.蕨類等
2.非洲紫羅蘭
3.百合等球根
4.馬鈴薯
5.香蕉
II. 組培瓶的物理特性
一.提供植株生長良好光環境
1.光量之影響
理想的組培瓶在承盤中可以得到最大與均勻的光線,因此有兩種決定因子：上層材料的透光性與瓶的形狀。最理想的形狀為圓頂型可以容納所有不同角度進入光線。在上方形狀無法為圓頂型時,不規則梯形是另一種選擇。上方材料必需防止結露,不能有水霧聚集於瓶蓋下方,以免阻礙光線進入。
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2. 光質影響
大多數組培苗係自培養基中得到碳來源，而非利用光合作用轉換CO2為C，,因此全PAR光譜對組培苗之重要性,不如對其他植物之重要。藍色光譜(430-490nm)促進芽莖(shoot)發展,紅色與遠紅色光譜(650-800nm)促進根發展(Rooting)。
PVC材料阻擋了大多數光源,藍光透光率僅有5%,紅光部份約40-50%。
二. 組培瓶苗之最大生長空間
3.植株最大之生長面積
組培瓶底面積愈大，栽培架上同一面積種植之瓶苗愈多。培養基與瓶頂之間為植株最大的生長空間。空間愈大則外界環境對內部環境之影響較慢。植株對氣體環境之變化愈有緩衝能力。
4.培養基放置之空間
植株放置培養基上成長。培養基之功能有:固定、通氣與提供養份。在培養過程中培養基不再添加，因此需要考慮原來之分注量可以提供完整栽培過程所需養份。
三. 環境調節之可行性
5. 組培瓶環境調節只能以本身物理特性配合外界氣象條件共同進行。
A. 組培瓶換氣率
組培瓶內外換氣率之影響因子有瓶栓材料,尺寸、緊密度、形狀、內外氣體濃度差等。
B.組培瓶之熱對流係數
組培瓶本身如同迷你小溫室。外界輻射熱容易引起內部氣溫增加,最有效的方式是利用熱對流帶走累積熱量。對流係數之影響條件有外界風速、組培瓶形
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狀、排列方式等。
四. 防止污染之能力
6.靜置時之污染防止
組培瓶靜置時其污染來自：a.自殺菌爐移出,在冷卻過程染；b.在準備室內植株未移入前染；c.接種或移植作業時，尚未動作而短暫靜置之污染；d.栽培室內之污染。
7.人為污染之防止
商業上組培苗量化生產之主要污染源來自人為作業。原因主要為以消毒未完全的工具接觸瓶內環境。因此移植用的鑷子,其消毒長度要大於組培瓶寬度、高度與最大對角線。
五、人力作業之方便與簡易
8a.人力作業之合理
在移植率作業中，人力作業方式愈合理作業能力愈高。每次移植作業有如下流程：(1).開蓋；(2).移植；(3)封蓋。
利用試管作業則每次移植植株1株即需要三項工作。以GA-7瓶而言,則在開蓋、封蓋間有多次移植作業。美國之研究資料顯示：操作者移植作業以連續5-15分鐘最合理。
8b.人力作業之合理
理想的組培瓶即是能用單手開瓶與封瓶。因此操作者可以用本身慣用的手持工具,另一隻手握持組培瓶。
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組培的作業空間必須配合人體工學。組培瓶很淺,其底部要配合基座以使其固定。組培瓶很深,要配合一個角度以方便植株移入。
9.人力之搬運能力
組培瓶有許多作業過程仍需要人力,因此其尺寸大小要適用單手持起。
美國廠商之建議標準為瓶蓋尺寸不可大於9公分，瓶內放置植株與培養基後不超過300g重。在搬運過程中，瓶內培養基要能避免傾斜。
六. 作業流程之合理化
10.耐破裂性
組培作業中組培瓶不免有掉落地面之機會，破裂容器引起了污染問題。輸送過程不免撞擊，因此要防止運動時可能破裂。
11.耐熱性
組培瓶要能承受120℃以上之高溫。
12.機械作業配合能力
針對未來機械化、自動化之需求,組培瓶必需配合以下條件：
(1).瓶頂、瓶底儘量平滑,以方便真空吸力作業也方便以三點支撐方式穩定組培瓶。
(2).側面上有凹處方便機械手臂抓取。
(3).容器成對稱,以減少定向機構之需求。
(4).結構強度抗機械撞擊力。
(5).側壁成平滑傾斜,以方便機械承接設計。
七. 經濟考量
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13.使用年限或次數(耐久性)
對回收之組培瓶要考慮其使用次數。在使用期限間物性可能變化。
使用回收瓶器則要考慮可無清洗機械。
14.貯存、輸送需求
組培瓶能被堆疊，堆疊之體積愈小,愈利於貯存輸送。
15.國內生產廠之製造能力
國內生產工廠有無能力製造，需要的材料能否供應。
III. 組培場佈置
組織培養室之規劃設計
植物組織培養苗生產所用之工場配置與其他工場生產最大的不同點在於其清潔的要求，空間內的雜菌濃度要處於最低的程度。而為了使生產作業合理順暢，除了空間內的清潔之外，也要合理安排如下的問題：
各項設備的配置
各項作業的動線配合
物料的搬運與儲孝
人員的人力能率配合
建築物部份
組培苗生產的建築物有兩種型態：1.決定從事組培苗生產時，尚未有建築物，因此可以依據內部之作業需要，決定建築物的空間安排。2.已有現成的建物，因此利用現有的空間加以修改或裝設各種建築材料以進行組培苗生產。
建築材料的要務在於必須具有良好的絕緣，使內部溫度能夠保持穩定。對小規模生產者而言，往往在建築物內再以絕緣材料分隔成另一工作室，由於工作室
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與建築物夾層之間有空氣絕緣外界熱量，因此室內溫度容易趨向穩定。但是在炎夏時，夾層熱空氣如果缺乏足夠風力加以排除，反而使工作室的溫度逐漸增加。
在空間規劃方面，因為組培苗生產過程需要經常搬運物料，因此以平面配置最好。將各種不同作業室全部佈置於同一層，避免上下樓層的搬運動作。
在電源方面，不斷電安全系統一定要加以裝置。至少在必要時空調系統必須能夠維持作業狀態，以避免栽培室內部植物受損。
通風作業一定要採用正壓力系統，使空氣之流動維持於向外吸出之狀態。
完備的組培苗生產場通常必須包括以下的作業空間：培養基準備室、清洗與殺菌室、操作室、培養室、冷藏室、辨公室、貯料室、工作人員休息室、包裝出貨室等。每個作業室的清潔程度，內部設備與空氣流通程度因其使用目的的不同。這些作業室的佈置，室與室之間連通的窗戶、門、走道等都必須使作業中物流維持於最大的清潔性，也必須避免在搬運時出現路徑後退或是交叉阻塞的現象。各作業室可以依需要規模加以合併。
組培場內各作業室因其清潔程度的要求又可分成兩型：儲料室、職員休息室與包裝室等作業室的空氣清潔程度可以維持與外界相近的正常狀態。但是培養基準備室、操作室、培養室與冷藏室都必須維持於清潔狀態。在進入此地區之前，必須通過腳踏粘墊以減少灰塵進入，人員在進入清潔區域之前，要更換衣物或載上髮罩、鞋套、手套等以降低工作人員帶來的污染源。
所有作業室要處於陽壓狀態。空氣自室內向外排出，因此外界空氣不能滲入。若是通風設備的風壓、風量能力不足，至少在清潔地區要維持於正壓力，外
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界空氣進入此區域一定要通過性能良好的過濾網。最佳過濾網組合係利用數組可丟棄的玻璃纖維濾網配合一具靜電過濾網。這些完備的過濾裝置其目的在於減少微生物進入清潔地區的數量，以避免污染了組培苗生長環境。
作業室
各類作業室的配置要求說明如下:
1.培養基準備室
培養基準備室屬於清潔地區，清潔程序要求高。地面與牆壁的表面儘量光滑以避免灰塵累積。
門板應該設有玻璃以便由外界能看到裡面的情形，利用滑動開啟方式，可以減少推拉門占用了內部空間。另一方面，減低了內外壓力急劇的變化。
在培養基準備作業與清洗殺菌作業是在同空間內進行。自高壓殺菌鍋逸出的蒸氣要以另一外的管路排出室外，以減少房間的熱質負荷。此作業室一定要以正壓通風換氣。
1. 清洗殺菌室
清洗殺菌室與培養基準備室應該相通，因此完成製作後充填於組培瓶內的培養基可送入清洗殺菌室進行殺菌。在此清洗室清潔完成的容器可送至準備室內充填培養基。在此清洗殺菌室必須具備另一座門以提供作業人員出入之用，以避免出入時經過準備室。在清洗殺菌室內的地面與牆壁必須能夠忍受高濕狀態，承受高濕蒸氣，並可以多次清潔。此外必須有通風性能良好的抽氣裝置以抽出高溫高濕的空氣。
1. 操作室
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在操作室必須處於極為乾淨的環境。進出操作室之前，應有空氣洗滌裝置，以沖走工作人員帶來的雜菌。地面使用磨石子地面最好再鋪設油布。牆壁儘量光滑以避免累積灰塵。也可利用紫外光殺菌燈在無人時用以進行室內殺菌。
減少操作室之污染
清潔維護的四大原則為：
a減少外界塵粒進入：保持足夠的正壓性，四周牆壁氣密良好，空氣濾清器要定期維護，人員與物料進入時要經過防塵清潔處理作業。
b室內塵粒之減少：室內物料不因動作而產生塵粒，工作人員作業時，降低雜質產生之機會。
c.室內塵粒不累積：牆壁與四角無死角，操作台或工作台下無死角產生。
d.室內雜質之排除：有足夠換氣量，通風路徑無死角。
1. 培養室(栽培室，Growth room)
培養室內之作業目的在於放置移植完成的培養容器，使得瓶內的培植體得以成長。對一組培苗生產而言，往往需要數間培養室，每間各有不同的溫度和光周期。每一培養室的冷凍空調機械最好獨立作業。在某間空調系統失敗後可移至另一間持續培養。
培養室內溫度分佈的均勻性十分重要。若是存有不均勻狀態，＂熱點＂的存在導至組培苗不正常的發育。組培苗玻璃質化的一項起因即是溫度過高所引起。為了促使溫度均勻，可以增加通風管路，對通風管角度加以調整，使空氣混合性更良好。
燈管裝置於栽培架上，其熱量將影響了周圍氣溫，直接影響了放置於上方承盤上的培養瓶溫度。改善方法有在培養瓶下放置絕緣板，但是會造成空氣流通
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