由液態培養測定三種纖維素分解酵Streptomycessp.
53-2具有較的CMCase及b-glucosidase活性，Avicelase活性不高。比較胞內及胞外CMCase及b-glucosidase活性，Streptomyces sp. 53-2具有較高的胞外CMCase及b-glucosidase活性。以不同纖維素及其衍生物為主要碳源培養Streptomyces sp. 53-2生產纖維素分解酵素，低黏稠度CMC培養可達到最高的CMCase及b-glucosidase活性。Streptomyces sp. 53-2培養於Mandels-Reese培養基時，於不同時期添加不同碳源發現，葡萄糖會抑制CMCase及b-glucosidase的活性。甘油對b-glucosidase有小幅度的抑制，對CMCase則無明顯相關。纖維雙糖無法看出對b- glucosidase的生產影響，但對CMCase會有抑制作用。在Streptomyces sp. 53-2的纖維素分解酵素基因選殖方面，選定散彈槍選殖（shot-gun cloning）方法，把純化之Streptomyces
sp. 53-2染色體DNA，利用限制酵素Sau 3A進行部份切割，收集6-12 kb片段大小之染色體DNA，與BglII限制酵素完全切割之pIJ702進行黏接，再將其轉形至Streptomyces lividans IAF 10-164所製備的原生質體中，進行纖維素分解酵素活性轉形株篩選。編號3177的轉形株在固態培養中分解環直徑為寄主分解環直徑的2.7倍，為可能具有纖維素基因的轉形株。耐高溫及中溫菌的分離及其纖維素分解酵素之研究為篩選適合堆肥醱酵之添加菌株，首先測定其各醱酵階段堆肥腐熟度，分析樣品pH值、水分含量、灰分含量、有機碳含量、總氮含量、固定態氮含量、C/N比及苜蓿種子發芽率等8項性質，再由各階段的樣品中篩選菌株，以選擇性溫度培養法（selective temperature method），採集樣品於50℃及30℃培養篩選及挑選纖維素分解菌株共51株，分別將之編號為耐高溫菌分離株CH1至CH27及中溫菌分離株CL1至CL24。初步判定有放線菌23株，真菌10株和細菌18株。分別以固態及液態基質測量三種纖維素分解酵素的活性，以編號耐高溫菌分離株CH18及中溫菌分離株CL5活性表現最佳，也較原分離菌株Streptomyces sp. No. 88活性表現佳。分離株CH18內切型纖維素分解酵素，外切型纖維素分解酵素及b-葡萄糖酵素之活性分別為3.860,
2.783, 0.537 U；分離株CL5則分別為2.141,
1.141, 1.141 U。分離株CH18最大細胞乾重為0.38 mg/mL，而分離株CL14為0.83 mg/mL。分離株CH18可在20至60℃生長，其最適生長溫度在40℃左右；最適生長pH值在5～7之間，纖維素分解酵素最適反應溫度約在40℃。分離株CL5可生長溫度範圍在20至40℃，其最適生長溫度30℃，最適生長pH值為6～9，纖維素分解酵素最適反應溫度是在60℃。篩選出適合生長在堆肥中的耐高溫與中溫菌株，可進一步研究製作生物性堆肥之可能性。以纖維素酵素與鳳梨酵素水解幾丁聚醣與羧甲基纖維素製備幾丁寡醣分別使用纖維素酵素及鳳梨酵素，對自製之魷魚軟骨幾丁聚醣及市售蝦殼幾丁聚醣反應，將其降解成N-乙醯幾丁寡醣(GlcNac)n及幾丁寡醣(GlcN)n，另外也以相同兩種酵素對羧甲基纖維素CMC反應後，測其寡醣生產量，與幾丁寡醣之產量作一比較。魷魚軟骨幾丁聚醣與市售蝦殼幾丁聚醣(DD=83﹪)於50℃、pH=5.2添加纖維素酵素及鳳梨酵素，經不同反應時間後取樣測量樣品之黏度結果顯示，以纖維素酵素反應之幾丁聚醣醋酸溶液之黏度下降程度較鳳梨酵素為快。在CMC羧甲基纖維素方面添加纖維素酵素於50℃，在不同pH值7與5.2之下，1﹪CMC溶液於pH=7時，反應剛開始黏度即快速下降，但至15分鐘後即有緩慢上升的趨勢。PH=5.2之1﹪CMC醋酸溶液在添加纖維素酵素5分鐘內黏度也快速下降，但其後黏度仍以緩慢速度下降，並無回升趨向。至於鳳梨酵素方面，在CMC經過添加鳳梨酵素後，黏度隨著時間增加也有下降趨勢。添加纖維素酵素經過不同時間反應後，CMC之重量平均分子量(Mw)之變化方面，也和黏度變化情形有一致之趨勢，在pH 7情形下之CMC溶液之重量平均分子量(Mw)在經過15分鐘後，由快速下降轉為上升，可能是以纖維素酵素水解CMC溶液時，在pH為中性情況下，CMC之分子鍵結被打斷後，不久又接回去所致。pH＝5.2之CMC醋酸溶液之在24hr後重量平均分子量(Mw)下降為8950(Da)
顯示，pH＝5.2之下纖維素酵素分解CMC溶液之效果較pH＝7時為佳。鳳梨酵素添加於CMC溶液中，經過24hr後重量平均分子量(Mw)下降至25074(Da)。魷魚軟骨幾丁聚醣在添加纖維素酵素經過20hr後重量平均分子量(Mw)下降至2867 (Da)，添加鳳梨酵素經過32 hr後重量平均分子量則下降至6845 (Da)。自製的魷魚軟骨幾丁聚醣以纖維素酵素水解24hr後，其單醣、寡醣產率約為89﹪，市售蝦殼幾丁聚醣以鳳梨酵素水解24hr後，其效果比纖維素酵素水解效果差，單醣、寡醣總產率為9.4﹪。至於1﹪CMC醋酸溶液在pH=5.2時添加纖維素酵素反應後之水解液，以透析法所得之寡醣總產率較低約為13﹪，以甲醇分離法將纖維聚醣分離後所得之寡醣部分經0.2μm之濾膜過濾後纖維寡醣之總產率為61﹪，且其寡醣之總產率隨cellulase水解反應時間的增加有略降之趨勢，推測為水解產生逆反應所引起之聚合現象。以鳳梨酵素水解CMC經48hr後產率約為11﹪，較cellulase水解效果差。靈芝屬纖維素分解脢cbh-1和egl-1之基因選殖、表現及分類演化靈芝為白腐型真菌，有些種類傳統分法不易鑑定。24株由惠蓀林場所採集的菌種進行分類研究，依形態區分，其中靈芝屬12株，樹舌亞屬9株，假芝屬3株。從基因資料庫取得靈芝的ITS1及ITS2的DNA序列，以kimura’s two-parameter model計算DNA序列的變異矩陣及Fitch-Margoliash演算法重建靈芝演化樹並與簡約法得的結果進行比較，建立演化的模型。其結果分成靈芝類群(細分為8個群)及樹舌類群(細分為11個類群)，而靈芝類群是為中心種，即演化上較原始的種類。歸群後所修正結果顯示DNA的演化和形態的演化的一致性。由所建構的演化模型之中選取24個ITS1序列作為分子鑑定比較之標準序列，將分離菌株進行纖維素分解酵素活性測試。其中10株具有纖維素分解酵素活性。並可以PCR增殖出外切纖維素分解酵素cbh1基因之800
bp的特異性片段。靈芝分離株G419之cbh1基因經由DNA定序及NCBI基因庫Blastx軟體比對和Iprex lacetus的CBH1有73 %的同質性，和Phanerochaete chrysosporium的CBH1有75 %的同質性。建構靈芝菌株G419的cDNA基因庫利用酵素表現篩選出具有內切纖維素分解酵素的轉殖株10株；其酵素蛋白質分子量可分為40 kDa及70 kDa二類。鹼處理農產基質對嗜高溫菌生產纖維酵素活性之影響鹼處理（0％、2％、4％及8％）農產基質（蔗渣及玉米穗軸）對於嗜高溫菌（一、二及三號菌株）的纖維分解酵素活性的影響，藉配合三個不同溫度處理（25℃7天、70℃ 90 m in及121℃ 60 min），來探討其對於菌體中三種纖維素分解酵素活性（CMCasAvicelase及β-glucosidase）的影響。結果顯示鹼處理生成之鹽類對菌株的影響上，以一和三號菌的忍受性較高。在鹼處理基質之後對於其糖化的影響不大，且滴定中和後所生成的鹽量並不足以對菌造成影響。在CMCase活性方面，以蔗渣為基質時，經121℃, 60 min ,0% NaOH處理，一號菌株有最高活性，其值為45.0 U/l。而在Avicelase活性方面，以蔗渣為基質時，經121℃,60 min ,0% NaOH處理，一號菌株出現最高活性，其值為51. 0 U/l。在β-glucosidase活性方面，以蔗渣為基質時，經121℃,60 min ,0% NaOH處理，一號菌經培養後會出現最高活性，其值為49.2 U/l。利用纖維素酵素製備幾丁寡醣及其免疫功能評估N-乙醯幾丁六醣具有增強免疫功能，由於其製備成本過高，無法實際應用。利用纖維素酵素水解蝦殼幾丁聚醣，得到具免疫活性之幾丁寡醣混合液。纖維素於三種不同濃度 ( 6、8、10mg/mL) 水解蝦殼幾丁聚醣不等時間 (1.5、2、2.5、3小時) 得到十二種不同組成的幾丁寡醣混合液，利用HPLC分析此十二種幾丁寡醣混合液的組成，以融合瘤細胞HB 4C 5、類人巨噬細胞UMf和類老鼠巨噬細胞J774.1對幾丁寡醣混合液進行免疫活性評估，發現酵素濃度8mg/mL水解2.5小時所得水解產物免疫活性最佳，其可刺激融合瘤細胞HB 4C 5增生1.7倍，比標準品N-乙醯幾丁六醣為高；刺激類人體巨噬細胞UMf增生1.3倍，略低於標準品N-乙醯幾丁六醣，對於類老鼠巨噬細胞J774.1增生情況則不顯著。與HPLC分析寡醣組成的結果對照，酵素濃度8 mg/mL水解2.5小時所得水解產物大於六醣的比例為最高 (22.6﹪)。取此條件之幾丁寡醣混合液進一步以乙酸酐進行乙醯化反應，分別得到乙醯度10、50、75、100 ﹪的幾丁寡醣混合液，進行免疫活性測試來確認最佳乙醯度，以乙醯度100 % (A 100) 的免疫活性最好。腹腔注射此N-乙醯幾丁寡醣混合液 (A 100) 於BALB/c小白鼠中，顯示N-乙醯幾丁寡醣混合液可增加小白鼠血清中IgG與IgM含量，其效果與N-乙醯幾丁六醣標準品相似。注射N-乙醯幾丁寡醣混合液之小白鼠淋巴細胞在Con A (Concanavalin A) 誘導下增生速率為控制組之1.6倍，注射N-乙醯幾丁六醣者僅為控制組之1.4倍，若以LPS(lipopolysaccharide)
誘導，注射測試樣品者淋巴細胞增生速率與標準N-乙醯幾六醣之效果相似，均高於控制組。快生型大豆根瘤菌纖維素分解酵素存在之確認與誘導之表現豆科植物可藉由和根瘤菌的共生關係而將空氣中的氮素固定下來以獲得氮源。而羧基甲基纖維素酶 (EC 3.2.1 .4,
CM-cellulase) 可能為根瘤菌與植物進行共生固氮作用時，分解植物細胞壁的關鍵酵素，得以順利進入並感染植物根毛細胞。以Sinorhizobium fredii CCRC15770為材料，確認羧基甲基纖維分解酶 (CM- cellulase) 的存在。使用myo-inositol來培養根瘤菌，使用氧化鋁
(aluminum oxide) 當助磨劑的乾式研磨法來磨碎菌體，收集在對數期的菌體各組成部分，以
ＢＣＡ法進行分析CM-cellulase活性，結果發現CM-cellulase是一種細胞鑲嵌 (cell associated) 蛋白。使用SDS-PAGE活性染色法來偵測S. frediiCCRC15770的CM-
cellulase，只發現一種CM-cellulase。以類黃素和根萃取物來誘導表現CM- cellulase，發現類黃素不具誘導的效果，但根萃物具誘導的效果。利用Trichoderma reesei生產飼料添加用纖維素酵素之探討以兔子為試驗動物，探討纖維素酵素對單胃草食動物生長之影響，並進一步探討微生物纖維素酵素的最適生產條件和特性。於生長兔（５－７週齡）及肥育兔（８－１０週齡）之日糧中分別添加纖維素酵素(Celluclast, Novo)及此酵素之微膠囊化製品，結果發現添加微膠囊化酵素能改善家兔之生長性能。家兔生長期之飼料效率，以添加微膠囊化酵素組最佳，其次為添加液體酵素組。對於肥育期間兔之攝食量及增重，對不同處理組間，雖不具與生長期相當之一致性，但其飼料效率仍以酵素添加組呈現較佳之趨勢。對於生長期間飼料之乾物質、粗蛋白質及粗纖維之消化率而言，則以微膠囊酵素添加組比其他組呈現較佳之趨勢。由於纖維素酵素添加之飼料能有效改善動物生長性狀，因此以Trichod- erma reesei (ATCC 13631)為對象，探討纖維素酵素之最佳生產條件，並進一步將酵素加以分離純化，探討此酵素之特性。結果發現於Mandels-Reese培養基中，1﹪ 的Avicel當做誘導劑，可得最佳之CMCase活性。T.
reesei纖維素酵素純化去除菌體後之粗酵素液，經超過濾(Amicon PM 10)處理，取得分子量大於10,000的濃縮液，再置入Sephadex G75膠體層析，再以DEAE Sepharose
CL6B離子交換層析純化，可得四個具CMCase活性的蛋白質區分，總回收率達44﹪。於in vitro探討飼料中添加四種不同形態之纖維素酵素對纖維之水解率，評估添加纖維素酵素之有效性。纖維素酵素包括Trichoderma reesei纖維素酵素、商業化纖維素酵素(Celluclast)、自行製備之微膠囊處理Celluclast及商業化已保護之Celluclast。結果顯示添加Celluclast、微膠囊及商業保護態之處理組，均能提高粗纖維之水解率，以經微膠囊之酵素效果最佳；自行分離自Trichoderma reesei的纖維素酵素對飼料纖維之水解並不明顯，可能所生產之纖維素酵素僅含高量的CMCase活性，抑或其他原因，有待再詳加探討。實際用於飼料添加時，將酵素給予保護，避免酵素受到胃酸破壞，並於腸內發揮其活性，即可達到添加酵素之目的。鏈黴菌Streptomyces griseus纖維素分解酵素基因的選殖及分子分析利用基因選殖方法，將鏈黴菌Streptomyces griseus中與纖維素分解脢活性相關的基因片段，選殖到不具纖維分解酵素活性的S.lividans 10-164菌株中表現，得到二株具纖維素分解酵素活性的菌株C3-16和C15-2，對其作進一步的基因次選殖及酵素活性分析。在C3-16菌株完成所含重組質體pCMC150的限制脢輿圖分析；在次選殖研究中pCMC150 (13.2Kb)以SacI切割後得到9.2Kb（含嵌接片段3.7kb）及4Kb（含嵌接片段3.8kb）片段，其中9.2kb部份不再保有纖維素酵素活性；如將4Kb片段再次選殖到pIH702時，不但能有纖維素分解脢活性，且活性還比原菌株C3-16還高。以Bg1
Ⅰ切割，引流出2.5Kb的片段再嵌接入702-pGEM3Zf(-)的Shuttle vector之Bg1 Ⅱ位置所構築的重組質體，進入鏈黴菌宿主中也不能表現纖維素酵素的活性。因此成功完成C3-16的次選殖工作。在菌株C15-2發現所含重組質pCMC8同時促進纖維素分解脢活性株S.lividans TK64及不具纖維素分解脢活性的S.lividans
10-164突變株之纖維素分解酵素活性。對pCMC8所含嵌接基因片段作DNA定序，結果發現此基因片段僅含275bp核甘酸。將pCMC8整個DNA序列及pCMC8的嵌接片段DNA序列輸入電腦分析後，找到4個可能的ORFs存在於pCMC8嵌接片段附近。另外以pCMC150及pCMC8之嵌接片製備DNA probe分別稱為probe
3-16及probe15-2，再分別和各種以Pst Ⅰ切割的鏈黴菌染色體DNA作南方轉漬混交。結果顯示在10株鏈黴菌中，probe 3-16和S.recticulus，S.lividans，S.argentilus，S.lipmen，S.rentilus等5株鏈黴菌的染色體DNA有混交訊息出現。probe 15-2則和S.griseoruber及S.lipmen兩株菌的染色體DNA有混交訊息出現，顯示這2個和纖維素分解酵素活性有關的基因片段和某些鏈黴菌染色體DNA的某一片段具核甘酸序列相似性。在生化特性方面，分析誘發纖維素分解脢產生的受質CMC之最佳濃度。結果顯示，對菌株C3-16而言，1.5%CMC為最佳濃度；菌株C15-2則以1.0% CMC可達最佳誘發纖維素分解酵素的生產效果。纖維素及半纖維素分解酵素的性質及利用稻草進行同時糖化醱酵之初步探討以處理過的稻草為碳源培養Trichomderma reesei QM9414，誘導產生纖維素分解酵素及半纖維素分解酵素，可得到較高活性之酵素液。其作用之最適pH值及溫度為：-xylosidasepH3.8、55℃；xyylanase為pH4.3、55 ℃；C 1 c ellulase為pH4.3、60 ℃；FP cellulase為pH4.8、55 ℃；Cx cellulase為pH4.8、60 ℃；β-glucosidase為pH4.3＜最適作用溫度高於65 ℃。糖化作用之最適pH值及溫度則為pH4.3、50 ℃。各酵素對pH值及溫度之穩定性不盡相同，以xylanase最不穩定，添加1 mg/m1的牛血清蛋白可提高酵素之穩定性。以處理過的稻草為基質進行糖化，其糖化產物含有纖維二糖、木二糖、大量木糖及葡萄糖和少量阿伯糖。利用糖化液醱酵產物探討其對酵素的影響，發現酒精對酵素稍有抑制作用，檸檬和乳酸酸則抑制效果較大。利用Sac-charomyces cerevisiae與Trichoderma reeseiQM9414所產生的酵素液進行同時糖化及醱酵，以5% 稻草為碳源，於37 ℃作用廿四小時後得總還原糖20.75mg/ml，較單獨利用酵素之糖化所得14.81 mg/m1為高。利用纖維素分解酵素吸附水解處理過之稻草由Trichoderma reesei QMa414培養所得酵素液研究水解處理過之稻草吸附的情形，測定酵素活性時發現Cx、C1、FP celulase及β-glucosidase均會瞬間吸附於稻草上。反應一段時間後，Cx、FP
cellulase會釋回反應液並穩定於反應液中。Xylanase除在稀釋酵素液有瞬間吸附外，其餘均無瞬間吸附及釋回反應液的現象發生。連續添加酵素、改變稻草顆粒大小與濃度、粗酵素液濃度、酵鹼值均會影響吸附百分比；添加化學物質及反應溫度在5 ～50℃之間(續于下章後段)
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