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1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜葉菊（品種為守田二號，甜菊糖甙含量為13.2%，由江蘇省江陰市德和生物科技有限公司提供）；HPP.L3 超高壓設備（天津華泰森淼生物工程技術有限公司），JSM -7600F
掃描電鏡（日本電子株式會社）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品製備新鮮甜菊葉在60 ℃下烘乾後粉碎，得到粉末狀樣品，放置於乾燥處備用。

1.2.2 超高壓提取稱取樣品10 g，轉入聚乙烯塑膠袋中，按照一定的液料比加入水，密封。室溫（25 ℃左右）下浸泡20min 後，在一定壓力下，浸提一定時間後，卸壓，過濾得到濾液，此為1 次浸提。連續浸提2 次，合併兩次浸提得到的濾液即為提取液。

1.2.3 高溫提取稱取樣品10 g，按照液料比15:1 加入已預熱的水，在80 ℃下恒溫浸提60 min，然後冷卻過濾得到濾液，此為第1
次浸提。再以10:1 的比例加入水，80 ℃下繼續浸提30 min後，冷卻過濾，重複此操作1
次，合併3 次浸提得到的濾液即為提取液。

1.2.4 蒸煮提取

在500 mL 燒杯中加入150 mL 水，加熱至沸後，加入樣品10 g，微沸狀態下浸提50 min 後，冷卻過濾，此為第1
次浸提。再以10:1 的比例加入水，繼續浸提20
min 後，冷卻過濾，重複此操作1 次，合併3 次浸提得到的濾液即為提取液。

1.2.5 甜菊糖甙的測定提取液中甜菊糖甙含量測定

1.2.6 提取液中其他成分的測定採用DNS 比色法測定還原糖含量，採用酒石酸亞鐵法測定多酚含量，游離氨基酸用茚三酮比色法測定。

2 結果與討論

2.1 壓力對甜菊糖甙浸出率的影響

Fig.1 The effect of pressure on the
yield of stevioside

注：液料比為15:1，浸提時間為30 min。由圖1 看出，當壓力低（<100 MPa）時，甜菊糖甙的浸出率較低。壓力達到150 MPa 後，其浸出率明顯得到提高但是超過200
MPa 後，甜菊糖甙的浸出率趨於平穩。導致這一結果的原因可能是升壓過程中，細胞內外產生的很大的滲透壓促使溶劑迅速通過細胞壁等組織的微小通道進入細胞內部，充分與甜菊糖甙接觸。較高的壓力還會引起蛋白質等大分子物質發生一定程度的變性凝聚，使細胞壁和細胞膜的結構變得疏鬆，細胞壁的通透性增強，傳質阻力大大降低，有利於甜菊糖甙的浸出。此外，卸壓時同樣會產生很大的反向壓力差，溶解了有效成分的溶劑迅速向胞外擴散，所產生的衝擊力也會給細胞器膜和細胞壁造成結構的破壞。

2.2 保壓時間對甜菊糖甙浸出率的影響

圖2 保壓時間對甜菊糖甙浸出率的影響

Fig.2 The effect of dwell time on the
yield of stevioside

注：液料比為15:1，壓力為200 MPa。

如圖2 所示，隨著時間的延長，甜菊糖甙的浸出率增大。當保壓時間超過3 min 以後，甜菊糖甙的浸出率變化不明顯。說明超高壓下細胞內的甜菊糖甙能夠在短時間內迅速溶解在水中並達到溶解平衡。這可能是由於在升壓和保壓階段，溶劑滲透的速度較快，導致細胞內部產生劇烈的渦流擴散，加快了甜菊糖甙的溶解速度。甜菊糖甙達到溶解平衡後再延長時間也不會使浸出率得到明顯提高，可能還會使一些有效成分由於長時間處於高壓條件下而遭到破壞。所以選擇3 min 作為保壓時間。

2.3 液料比對甜菊糖甙浸出率的影響由圖3
可知，增加溶劑的量可以提高甜菊糖甙的浸出率，但是添加的溶劑的量超過甜菊葉品質的15倍以後，浸出率趨於平穩。超高壓作用使得大部分甜菊糖甙溶解于水中，但仍有少量的甜菊糖甙由於細胞組織結構的阻礙以及蛋白質等大分子物質的包埋等作用而不能夠與溶劑充分接觸。因此，當達到溶解平衡後，即使增加溶劑量也不能提高甜菊糖甙的浸出率。

圖3 液料比對甜菊糖甙浸出率的影響

Fig.3 The effect of solid-liquid ratio
on the yield of stevioside

注：壓力為200 MPa，浸提時間為3 min。綜上所述，超高壓提取甜菊糖甙的工藝條件為壓力：200 MPa，保壓時間：3 min，液料比：15:1。

2.4 超高壓提取法與傳統提取法的比較

2.4.1 提取工藝的比較

超高壓提取法與高溫提取法、蒸煮提取法的工藝比較。

表1 不同提取方法的工藝比較

從表1 中可知，超高壓提取法與高溫提取法和蒸煮提取法相比，甜菊糖甙的浸出率較高，分別提高了7%和2%。超高壓提取一方面降低了能耗，縮短了浸提時間減少了浸提次數、用水量和廢水的排放。另一方面，超高壓對於一些熱敏性物質的提取具有重要的意義，可以避免有效物質的損失或變性。此外，超高壓還具一定的滅菌作用[11]，可以簡化生產工藝。

2.4.2 提取液中其他成分的比較

分別對三種不同提取方法得到的提取液中的還原糖、多酚和游離氨基酸的提取率進行比較，如表2 所示。

提取率(%)=[提取液中某種成分的含量(g)/甜菊葉的品質(g)]×100%

從表2 可見，還原糖、茶多酚和氨基酸的浸出率隨著提取溫度的升高而增大，特別是還原糖和茶多酚受溫度的影響較大，所以超高壓低溫提取與其他兩種方法相比，在保證目標有效成分較高浸出率的前提下可以減少其他成分的浸出。這有利於降低提取液的粘度和目標產物的分離純化難度。表2 提取液中其他成分提取率的比較

Table 2 The comparison of the
extraction rate of the other

components

2.5 超高壓提取對甜菊葉顯微結構的影響

由甜菊葉的電鏡掃描顯微圖片可以看出，提取甜菊糖甙前的甜菊葉的組織結構完整，表面平整，而經超高壓提取後甜菊葉的組織結構變得疏鬆，出現斷裂，比表面積增大。說明超高壓不僅能在升壓和降壓過程中提高溶劑的滲透速率，而且還能在一定程度上破壞甜菊葉的組織結構，從而有利於甜菊糖甙的浸出。這與文獻報導中超高壓能使植物組織變得鬆散多孔，有利於目標成分的溶解相吻合。

超高壓提取時塑性:

袋未抽真空，會殘留少量空氣，而且甜菊葉的毛細孔道中也會留有空氣，所以升壓時部分空氣溶解于水中，另一部分則被壓縮至很小的體積。卸壓的速度較快，細胞外壓力在短時間內降為常壓，但是細胞內壓力仍很大，溶劑迅速向胞外滲透，當胞外的壓力低於空氣的分離壓力時，被壓縮的空氣體積迅速膨脹，已溶解的空氣也會溢出溶劑，形成“氣穴”現象。氣穴引起的能量釋放和溶劑衝擊力會使細胞急劇膨脹，足以使細胞膜、細胞壁等組織結構變得鬆散，出現許多孔洞。若這種細胞形變超過其承受極限，就會導致細胞破碎。細胞組織結構的破壞使得傳質阻力大為降低，有利於細胞內的有效物質迅速溶解于水中。

3 結論 與傳統提取方法相比，超高壓提取法的甜菊糖甙浸出率高，時間短，工藝簡單，而且提取液具有明顯的甘甜氣味。說明超高壓提取能有效地保持熱敏性或揮發性物質的活性，而傳統方法，特別是蒸煮法的提取液沒有甘甜氣味，顏色較深，給後續分離純化甜菊糖甙帶來困難。實驗結果表明，利用超高壓技術從甜菊葉中提取甜菊糖甙的方法完全可行，為甜菊糖甙的提取提供了一種新的途徑.------------------

50年來，大慶作為國家的重要能源基地，創造了中國石油以至世界同類油田開發史上的奇跡。大慶作為一個資源型城市發展到今天，面臨著可持續發展與石油資源遞減的矛盾和產業結構單一的困惑。市委、市政府一直高度重視大慶經濟轉型和可持續發展問題，1992年建立了大慶高新區，提出二次創業，積極推進大慶經濟轉型，以便實現可持續發展。特別是近幾年，圍繞構建全面發展戰略新高地，建園區、引企業、上專案，初步形成石化、乳製品加工、農產品深加工、機械和電子等接替產業發展框架，經濟轉型和可持續發展工作取得初步成效。根據市委、市政府提出的儘快壯大農村經濟實力和鞏固擴大綠色、特色農產品基地的政策，建議在大慶周邊農業區縣建立甜葉菊種植基地，並同時建立甜葉菊甙加工產業，形成一個高附加值的新型產業鏈。

一、甜葉菊及甜葉菊甙1969年，日本的住田哲也教授在巴西山區發現了一種很甜的菊科植物，人們叫它甜葉菊。甜葉菊屬菊科草本植物，別名甜菊、糖草、甜草，產於南美洲巴拉圭、巴西的原始森林小山坡雜草叢中。甜葉菊是一種很有價植的糖料作物，整株都含有糖分，是一種新型糖源作物，被稱為“第三糖源”。我國自1976年開始由南京中山植物園、中國農業科學院等科研單位先後從日本引進甜葉菊試種成功，80年代初向全國各地推廣種植，現已在20多個省市栽培，主要以生產甜葉菊幹葉為主，甜葉菊幹葉主要出口日本。部分地區建有甜葉菊甙加工廠，生產的產品也是以粗品為主。目前除中國、日本引種和推廣外，韓國、泰國、菲律賓等也有不同程度的推廣栽培.甜葉菊甙是從乾燥後的甜葉菊葉中抽提出的一類具甜味的萜烯類配糖體，是一種極好的天然無熱量高倍甜味劑，它在體內不參加代謝、不蓄積。甜葉菊甙在甜葉菊的葉片中含量最高，為14%，枝梗的甜葉菊甙相當於葉片的一半。目前為止，已從甜葉菊中分離得到8種不同甜度的甜葉菊甙。其中Stevioside是主要成分，占60%～70%，甜度為蔗糖的300倍；其次是Rebaudioside
A，占15%～20%，甜度為蔗糖的450倍，且甜味最接近蔗糖，其他組分含量都較少。甜葉菊甙主要有3種基本類型：①淡棕色粗提取物，為40%~50%純品；②微黃色，為80%～90%高等純品；③白色粉末狀，為90%以上精品。甜葉菊甙易溶于水，不溶於丙二醇或乙二醇，在空氣中吸濕性強，乾燥失重為1.5%～4.0%。與蔗糖混合使用有顯著的相乘效果。同時，甜葉菊甙具有良好的耐熱性，不易見光分解，在95℃下加熱處理2h甜度不變，即使加熱8h甜度降低也很少。甜葉菊甙在pH
3～9範圍內穩定，並100℃下熱處理1h也無變化。甜葉菊甙耐鹽性良好，無美拉德褐變現象，不能作為微生物生長的碳源，因而可延長發酵製品的保質期。甜葉菊甙在NaIO₄（高碘酸鈉）和KOH（氫氧化鉀）的催化下可以被水解為甜葉菊糖醇，然後通過甲醇結晶可以得到純品甜葉菊糖醇（isosteviol），使用酸水解（10%硫酸）也可以得到異甜葉菊糖醇。70年代起，日本、美國、韓國、巴西等國家先後進行過動物急性毒理、亞急性毒理、長期毒理學試驗。日本藥理學家明石和光橋（1978～1982年）進行數次反復試驗，發現甜葉菊甙對動物無任何毒害作用，且對腫瘤病變有控制作用。在對糖尿病病人的用量試驗中，未發現任何副作用，且對人體代謝功能無任何不良影響。其安全性已得到國際FAO和WHO等國際組織的認可，2004
年7 月6 日世界聯合衛生組織正式通過允許甜菊糖甙在世界範圍內使用的決議，這為甜菊糖甙的安全性提出了有利的證明。2008年12月18日，美國FDA又正式宣佈甜菊糖甙可在全美國作為一般甜味劑代替白糖使用，極大地擴展了該產品的市場需求。由此可見，甜葉菊被國際上廣泛採用作為一種安全的天然甜味劑具有極大的市場前景。二、市場需求與效益近年來，甜葉菊甙作為一種新的糖源和食品添加劑，引起了世界各國的注意，甜葉菊甙的國內外市場需求量也呈現出不斷增長的態勢。有關資料統計，2005年，全球甜葉菊幹葉的年需求量已達到200萬噸，我國目前甜葉菊幹葉的生產量還遠遠不夠，每年還要進口約600-800噸。當前，世界上需求甜菊糖甙的總量大約在10000噸左右，需求最多的國家是日本，其年需甜葉菊甙500噸左右，大部分從中國進口。韓國年需甜葉菊甙600 噸左右，美國年需甜葉菊甙700 噸左右，俄羅斯年需甜葉菊甙200 噸左右，東南亞和我國臺灣也有很大需求量。隨著食品加工業及消費者對甜葉菊甙這種天然甜味劑或食品添加劑的認識提高，除了日、韓等國用量逐年增加外，其他國家也開始大量使用。甜葉菊甙所具有的獨特優點對人們有極大的吸引力。目前，90%甜葉菊總甙（HPLC）、A₃甙＞60%、無苦甜葉菊甙等規格的產品，在國際市場上供不應求，國際市場需求價90000元/噸（人民幣）近兩年，中國甜葉菊整體市場開始呈現供不應求的形式，眾多甜葉菊加工廠商由於沒有足夠的原材料而無法進行擴大生產。據調查，2006年甜葉菊幹葉售價為6～9元/公斤，2007年甜葉菊幹葉售價上漲至12元/公斤，2008年的收購價是14.6元/公斤。普通情況下一畝地每季可產幹葉200公斤左右，總收入可達2920元/畝，扣除化肥、農藥等成本，種植甜葉菊的年純收入可達2420元/畝，是同等條件下種植水稻、花生等農作物收入的幾倍。而在恰當的種植管理條件下，其產量最高可達700公斤，這種情況下每畝地的經濟效益可達到萬元以上，由此可見甜葉菊種植業具有潛在的巨大經濟效益，可帶動農民增收，促進農村經濟發展。目前，中國已成為全球最大的甜葉菊生產與出口國，佔據全球甜葉菊市場的80％以上。從國內市場看，我國每年要消費近9000噸的人工甜味劑，如果用甜葉菊甙取代30％的人工甜味劑，則國內市場每年需3000多噸甜葉菊甙。而目前我國每年才生產2000噸左右甜葉菊甙，市場潛力十分巨大。按15噸甜葉菊葉生產1噸甜葉菊甙計算，國內每年大約消耗甜葉菊幹葉30000噸左右，加之我國每年有上千噸的甜葉菊葉出口，因此我國每年需生產、貯備40000噸甜葉菊幹葉。如果按平均每年畝產幹葉500斤計算，需穩定種植面積16萬畝以上，而目前我國甜葉菊主產區的總種植面積不足10萬畝。

三、甜葉菊甙的應用甜葉菊甙作為一種新型糖源，其甜度高、熱量低，還具有重要的保健功能，如促進新陳代謝、強壯身體和降低血壓等，目前在食品、醫療、日用品等領域得到了廣泛的應用。（一）在食品行業的應用人們習慣用白糖、紅糖、葡萄糖等作為食品甜味劑，這些糖有營養，熱量也高，食入體內過多對健康有一定影響，例如兒童食入過多，會引起蛀牙，成人食入過多會引起肥胖病、動脈硬化症，糖尿病患者更要嚴格禁止吃糖。隨著科學的發展，食品行業已用甜葉菊甙來代替白糖、紅糖、葡萄糖及人工甜味劑做低熱食品，不但無副作用，而且能治療某些疾病。1、茶。用甜菊葉直接制茶或與其他原料茶配合製成的茶，對糖尿病患者降血糖，對健胃促進消化，醒酒和消除疲勞，對肥胖病、高血壓及齲齒等病患者均有防治作用。目前，國內市場上的降糖茶如（康寧茶），寧紅減肥茶，烏龍戲珠棗茶，紅花茶等，均含有甜菊成分，有的已銷往國外市場。 2、飲料。用甜葉菊甙代替蔗糖製作汽水、桔子汁、健力寶、娃哈哈以及各種果汁、霜淇淋等，具有特殊口味和保健作用。 3、點心。用甜葉菊甙加工而成的甜菊益康樂、甜菊月餅、餅乾等，成為營養、保健，以及兒童、老年人特殊需要的食品。 4、罐頭。甜葉菊甙可用於水果罐頭，如糖水楊梅、桔子、山楂、龍眼等；水產品以及肉類罐頭等，甜葉菊甙既起到調味功能亦發揮防腐延長保質期作用。 5、淹制品類。用甜葉菊甙淹制蘿蔔等醬菜以及榨菜，具有保鮮期長，清醃味美，不腐爛的特點。6、水產品。加入甜葉菊甙可防止水產品蛋白質腐敗變質，在改善水產品風味的同時還降低成本。如各種魚罐頭、海帶等。 7、酒類。用甜葉菊甙加入刺梨、沙棘、葡萄等果酒以及白酒中，可減除酒辛辣味改善風味。還可以增加啤酒泡沫、潔白、持久。8、肉食品。用甜葉菊甙加入香腸、火腿腸、蠟肉等食品中，可改善風味，延長保質期。9、口香糖及日化產品。用甜葉菊甙加入口香糖、牙膏中，既可促進產品甜味，又可降低口腔有害細菌增殖，減少齲齒發生。多種牙膏、口香糖以及化樁品中已應用甜葉菊甙。（二）甜葉菊甙及其衍生物在治療心血管病方面的應用

2001年，Lee CN等人發現甜葉菊甙具有一定的抗血壓作用。2004年，Wong KL 等人證明異甜葉菊糖醇對小鼠的主動脈肌肉有鬆弛作用。2004年，張雙捷等人證明異甜葉菊糖醇可以有效減輕缺氧複灌引起的左心室舒縮功能下降、心肌纖維和線粒體損傷，異甜葉菊糖醇有抗心肌缺氧修復損傷作用。2003年，Hsieh MH等人發現甜葉菊甙對患者的心臟收縮壓及心臟舒張壓有降低作用。因此，高純度的甜葉菊甙可以用於臨床治療高血壓。（三）甜葉菊甙及其衍生物在治療糖尿病方面的應用 2002年，P.B.Jeppesen等人證明瞭甜葉菊甙對分離的胰島和beta細胞具有直接的促胰島素分泌效應，明顯降低血糖水準和抑制高血糖素分泌。 2004年Gregersen S等人發現服用甜葉菊甙能夠明顯降低午餐後血糖的提高幅度。2006年，J Hong L Chen等人發現肥胖症患者服用甜葉菊甙可能有促進減肥的作用。因此，甜葉菊甙可用於臨床治療糖尿病和預防肥胖症。（四）甜葉菊甙及其衍生物在其他疾病方面的應用2004年，Shiozaki Kazuhiri.等人證明甜葉菊甙對組胺傷害胃黏膜引起的上皮細胞脫落、增生等具有保護作用。2002年，Yasukawa K等人證明瞭甜葉菊