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**微生物之培養與鑑定……!!

一、依形態區分

１．固體培養基：含1.5~2%Agar(固化劑)

２．液體培養基：不含凝固劑

３．半固體培養基：含0.5%Agar（固化劑）

二、依作用區分

１．基礎培養基

僅含微生物生長之基本營養素。

２．優厚培養基(enriched
medium)

除生長基本營養素之外，另添加特殊成分，促使無法在基礎培養基之微生物能生長。

３．選擇培養基

培養基中加入特定之營養物質，僅供特定微生物利用生長，而其他微生物則無法生存。例如EMB agar對大部細菌有抑制，而對腸道細囷能分解乳糖者，則無抑制。故可將E.
coli與產氣桿菌從細菌群中分離。

４．鑑別培養基(differential
medium)

在普通培養基中加入特殊物質，讓欲分離之微生物吸收而呈特殊效應，可運用於菌類培養基、藻類培養基、原生動物培養基。

例如培養基內加乳糖或指示劑，觀其是否醱酵或變色；膠團桿菌加甲苯甲酸鈉呈黃綠色。（活性污泥法應用之）

５．分析培養基

依加入培養基後之生長情況，得佑何者為抑制劑，何者生長劑。

２培養方法

一、純種培養(prue
culture)

培養單一菌種衍生之細胞群。

（一）好氧培養

１．劃線法(streak
culture)

利用接種環在培養皿平盤上之固態營養基表面逐次劃直線，每次起始點均含蓋上次直線之末段，使達到逐漸稀釋之效應。

２．斜面法(slant
cultrue)

將含凝固劑之培養基於試管中作成斜面，再以接種環在斜面劃線接種培養。

３．穿刺培養法(stab
culture)

將未凝固之培養基倒入直立試管中，凝固後將囷種以刺針垂直接種，藉以觀察菌體之運動性。

４．注入培養法(poru
cultrue)

利用無菌液態培養基作為稀釋液，將菌體懸浮液作連續式稀釋，再倒入培養皿培養，此法主要目的為菌體之分離。

（二）厭氧培養

１．化學試劑

利用pyrogallic acid 與NaOH作用會消耗氧氣之原理，在密閉容器中，促使此反應進行而造成厭氧條件，但須避免NaOH接觸菌體。

２．特殊裝置

（１）GasPak system

加水至GasPak發生器作用生成H₂及CO₂，以Pd作催化劑促使O₂與H₂反應而變成厭氧狀態。

（２）Brewer無氧瓶

瓶內通入H2後密閉，再通電流促使下列反應：

2H₂+O₂→H₂O

消耗氧而生成之水以CaCl_２吸收。

二、混合培養（mixed
culture）

培養對象為一群不同種類之微生物,在培養容器內控制住生長營養及培養溫度、pH等環境條件，使微生物群自然達平衡之狀活性污泥之培養需要：

（一）微量營養劑溶液

包含FeCl₃、MnCl₂.4H₂O、ZnCl₂、CuCl₂.2H₂O、Ca Cl₂.6H₂O、Na₂B₄O₇.10H₂O、檸檬酸鈉等成分配方。

（二）基質溶液

微量營養劑溶液、KH₂PO₄、NaH₂PO₄.H₂O、HN₄C l、(NH₄)₂SO₄、CaCl₂、MgCl₂.6H2O、葡萄醣及酵母菌萃取劑，以蒸餾水配置而成。

（三）活性污泥植種

由污水處理廠採取新鮮活性污泥培養。

３　微生物生長量測定

一、菌數測定(Total
count)

１．平盤計數

以注入法培養微生物，其稀釋倍數使平盤培養之菌落數３０～３００個為原則，每一個菌落為一個菌體所繁殖生成，故可由菌落數與稀釋倍數計算微生物數或密度。

２．顯微鏡計數

將樣本以適當倍數稀釋後，以具方格之玻片在顯微鏡觀察計數菌數，再換算水樣之菌體數量或密度。例如紅血球計數、優養藻類密度計數。

３．過濾計數

以無菌水選擇適當稀釋倍數連續稀釋，取稀釋水樣１０ ０ml經薄膜過濾後，該濾紙３ ５℃ ，２４小時培養計數菌落數。例如Coliform之計數。

二、菌體乾重測定

取適量水樣經薄膜過濾，濾紙以１０ ５℃ 乾燥除去水分，稱其乾燥前後重量差。例如黴菌之測定、活性污泥微生物量之測定。

三、菌體氮量測定

測定菌體中氮之含量，再換算成菌體量。

四、菌體濁度測定

以分光比色計(sepectrophotometer)測定其濁度用以表示菌體密度，適用於細菌類。

五、菌體活性測定

測定菌體所產生之能量(ATP)，用以表示微生物量。

４微生物之分離與鑑定

一、微生物分離技術

（一）Streak(or
spread)Plates劃碟法

將接種環燒紅滅菌，待冷卻再取細菌樣品，依同方向一劃線（將培養皿微開），此具有稀釋作用，使每區菌數漸稀，菌落能分開而單獨產生，劃定後放入保溫箱中培養，３ ７℃ ，２４hr。

（二）Poured
plates倒碟法（注入法）

以稀釋水稀釋菌種水樣３～４次，取出 １ml，置於已滅菌( 121℃，15psi，15min)之培養皿中央，再倒入培養基（液），搖動混合均勻，培養後取出計數，即知1ml內之細菌數。（稀釋水含MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄緩衝液）。

二、鑑定(Identification)

（一）顯微鏡觀察

菌體外形、大小、排列、運動性、染色、顏色、透明度，孢子染色、莢膜染色、鞭毛個數，添加酸性酒精是否變色。

（二）生化特性

１．碳源之利用：如乳糖之利用，產生酸使pH值降低，產生H₂O、CO₂，澱粉（I₂-KI）。

２．氮源之利用：如胺基酸利用產生H₂S，NH₃

３．硝酸鹽之作用：NO₃^-→NO₂^-→HN₄⁺

４．酵素之作用：尿素分解NH₃、CO₂

例如IMViC test為大腸桿菌及產氣桿菌之鑑別試驗

（１）    
I: Indole test

細胞色素氧化脢 Cytochrome
Oxidase  Tryptephane(含pepton)→indole

經培養如有indole代謝中間產物存在遇了醚會呈紅色，結果E.coli呈陽性反應(紅色)，而產氣桿菌呈陰性反應。

（２）    
M: Methyl red test(測試pH值)

E.coli培養液中產生酸使pH<4.5，則呈紅色反應為陽性產氣桿菌培養液不產生酸則pH>4.5，呈黃色反應為陰性

（３）    
Vi: Voges-Prokauer reaction

此反應在測試葡萄糖經分解後是否產生acetylmentyl
carbinol代謝產物，此代謝產物與培養液中之冗酸作用，會產生紅色化合物。大腸桿菌不呈紅色，產氣桿菌呈紅色

（４）    
C: citrate test

產生桿菌可利用檸檬酸(Citrate)作為唯一碳源而生長，而E.coli則否。

污水中微生物種類眾多，欲分離菌種需先連續稀釋後，再接種培養，使生長之菌落各自分開，每一菌落即為一隻細菌所衍生出之菌群，經探針謹慎挑起單獨培養即能達菌種純化之目的。

分離方法 水樣經連續稀釋後，採用 劃碟法
 倒碟法

純化（純種培養）將分離出之單一菌落挑出，接種至培養液(broth)或斜面培養基中，使其大量繁殖，以利檢驗研究。

鑑定可分為形態鑑定及生化鑑定兩類。

形態鑑定利用染色技術及顯微鏡觀察，區別菌種之大小、形狀、挑列、運動性顏色、莢膜、鞭毛、纖毛等特徵。

生化鑑定利用化學試劑檢驗該微生物之代謝需求（碳源、氮源）或產物，藉以判斷認定菌種。例如IMVIC test、血清試驗。

碳源試驗：乳醣之利用；檸檬酸鹽之利用

氮源試驗：氨基酸、硝酸鹽或尿素之利用