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DNA提取概述  DNA提取分爲三個基本步驟，每個步驟的具體方法可根據樣品種類、影響提取的物質以及後續步驟的不同而有區別。利用研磨或者超聲破碎細胞，並通過加入去污劑以除掉膜脂。加入蛋白酶，醋酸鹽沉澱，或者酚／氯仿抽提，以除掉細胞內的蛋白，如與DNA結合的組蛋白。將DNA在冷乙醇或異丙醇中沉澱，因爲DNA在醇中不可溶而黏在一起，這一步也能除掉鹽分。另外，目前也有利用吸附過柱的方法提取DNA的商業化試劑盒。

DNA的檢測  二苯胺（DPA）指示劑能夠證明DNA的存在。在酸中加熱後，含有去氧糖的DNA水解，2-去氧核糖轉變為ω-羥基菊芋糖醛（ω-hydroxylevulinyl
aldehyde），與二苯胺反應，產生藍色的化合物。DNA濃度可以利用分光光度計通過測量溶液在600nm的吸光度來計算。測量DNA純度的方法是測量DNA溶液在260和280nm的吸光度。DNA吸收260nm處的紫外光，而蛋白質吸收280nm處的。一個較純的DNA樣品應該基本不含蛋白質，因此260/280的吸光度比值應該較高。DNA也可以通過內切核酸酶切開後跑膠，與已知濃度的DNA分子量標準（marker或者ladder）對照來測定濃度。

DNA的使用  提取得到的基因組DNA包含細胞核和線粒體DNA（真核生物）以及葉綠體DNA（植物和藻類）。這些DNA可用於法醫學鑑定、診斷和系統發育研究，以及用於進一步的聚合酶鏈式反應（PCR）以獲得DNA中的特殊信息。純化得到的DNA也可用於研究DNA結構和化學性質，檢驗DNA-蛋白質相互作用，進行南方墨點法雜交，克隆和測序。  聚合酶鏈式反應 PCR

聚合酶鏈鎖反應，Polymerase chain reaction，簡稱PCR，是一種分子生物學技術，用於擴增特定的DNA片段，這種方法可在生物體外進行，不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。PCR這項技術，被廣泛地運用在醫學和生物學的實驗室，例如用於判斷檢體中是否會表現某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、基因複製，以及親子鑑定。

PCR這項技術是由凱利·穆利斯(Kary Mullis)發明，並因此在七年之後，1993年10月，獲得了諾貝爾化學獎該項殊榮。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反覆相同程序的方法，並利用一種特殊的酶——即DNA聚合酶來擴增特定的DNA片段。DNA聚合酶天然存在於生物體內，在細胞分裂前進行DNA的複製。當DNA開始複製時，解旋酶將雙股的DNA分開成兩個單股。DNA聚合酶便結合在兩DNA單股鏈上，生成互補鏈。在穆利斯最初的PCR反應中，將DNA聚合酶用於體外試驗。雙鏈DNA被加熱到96℃，使得雙鏈分離成為兩條單鏈。但是在這個溫度下，DNA聚合酶被破壞，因此在每個循環的加熱步驟後必須補充新的聚合酶。穆利斯的原始PCR反應效率極低，需要大量時間和DNA聚合酶，並且在整個PCR反應中都需要人來照看。後來，由嗜熱細菌水生棲熱菌(Thermus aquaticus)體內產生的DNA聚合酶改善了這種低效的PCR反應。由於嗜熱細菌生活在溫度達到50至80 °C (122至176 °F)的間歇泉中，它的DNA聚合酶具有耐熱性。在用於PCR反應時，高溫並不能破壞這種DNA聚合酶，因此不需要不斷加入新的聚合酶，PCR反應由此變得簡單並且可以由機器操作。 最初的具有耐熱性的DNA聚合酶來自於水生棲熱菌(Thermus aquaticus)，因此被稱為Taq。Taq酶被廣泛用於當前的PCR操作中，Taq酶的缺點是它缺少3'->5'校正外切酶活性，因此在複製DNA時有時會出錯，造成DNA序列突變(錯誤)。從古菌中獲得的Pwo酶及Pfu酶均有校正機制，能夠大大降低PCR反應中的突變。將Taq與Pfu結合使用可以保證真實準確得擴增DNA。專利之爭   PCR技術的專利由Cetus公司持有，穆利斯發明PCR技術的時候在那個公司工作。Taq聚合酶也受專利保護。關於這個技術有幾個訴訟案，包括著名的杜邦訴訟案。製藥公司
Hoffmann-La Roche於1992年買下了專利並持有至今。在世界各地的多個司法管轄區，羅氏與Promega公司與Taq聚合酶相關的專利爭鬥仍然在繼續。法律上的爭論已經超出了PCR和Taq聚合酶專利的期限，這些專利已於2005年3月28日到期。

操作過程 
PCR 用於擴增一小段已知的DNA片斷，可能是單個基因，或者僅僅是某個基因的一部分。與活體生物不同的是，PCR只能複製很短的DNA片斷，通常不超過10kbp。DNA是雙鏈分子，因此用互補DNA雙鏈的構造單位(核苷酸)來度量其大小，單位為鹼基對（base pair, bp）。某些特定的方法可以擴增40kbp左右的片斷，但是這種大小與真核細胞的染色體DNA相比仍然是很少的。例如，人的體細胞DNA含有大約30億個鹼基對。 目前應用的PCR反應需要幾個基本組成：

DNA模板（template），含有需要擴增的DNA片斷。

• 2個引子（primer），決定了需要擴增的起始和終止位置。（見下面引子一節）


• DNA聚合酶（polymerase），複製需要擴增的區域。


• 脫氧核苷三磷酸（dNTP），用於構造新的互補鏈。


• 緩衝體系，提供適合聚合酶行使功能的化學環境。

PCR反應在熱循環設備中進行。PCR儀可以將反應管加熱或冷卻到每步反應所需的精確的溫度。為防止反應體系中液體產生蒸氣，通常在反應管上加蓋加熱的蓋子(比加熱板溫度來的高)，或者在反應體系表面加入一層石蠟油。

引子  
特定的引子決定了所擴增的DNA片斷。引子是人工合成的短DNA片斷，一般不超過50個鹼基(通常18－25個)，它們與所要擴增的DNA片斷的起始和終止區域完全互補。在「黏合」時引子結合於DNA模板的起始和終止點，DNA聚合酶結合到這兩個位置，開始合成新的DNA鏈。選擇引子的長度和熔點(T_m)要考慮許多條件。引子的熔點與PCR第一步中DNA的熔點不同，是指50％的引子與模板結合的溫度，高於這個溫度引子與模板就不能有效結合。這個溫度隨著引子長度的增加而升高。如果引子長度太短，就有可能與DNA模板的幾個位置結合，造成非特異性複製。另一方面，引子長度也受限於T_m。如果T_m太高，即高於80℃，也會導致問題，因為DNA聚合酶在此溫度下活性較低。引子最優長度通常為20到40個鹼基，熔點從60℃到75℃。有時也用到簡併引子，是一些相似但不相同的的引子的混合物。通常用於從不同的生物DNA中擴增相同的基因，因為這些基因通常都是近似但不相同的。應用兼并引子的另一種情況是根據蛋白質序列設計引子時，由於幾個不同的密碼子都能編碼一個胺基酸，通常難以判斷在DNA中究竟是哪個密碼子編碼的這個胺基酸。例如編碼異亮氨酸的引子可能使用"ATH"，A是腺嘌呤，T是胸腺嘧啶，H可能是腺嘌呤，胸腺嘧啶或者胞嘧啶(關於鹼基如何編碼蛋白質，可查看遺傳密碼)。使用簡併引子在很大程度上降低了PCR擴增等特異性，這個問題可以使用遞減PCR(touchdown PCR)部分地解決。

基於上述考慮，設計引子可以採取以下原則：

• GC所佔比例為40％－60％


• 計算兩個引子的T_m，使之不相差5℃，並且擴增產物的T_m與引子的相差不超過10℃。


• 黏合溫度通常比計算的最低T_m低5℃，但是要根據經驗為不同條件下的PCR選擇不同的黏合溫度。


• 內部的具有自身互補性的髮夾結構不超過4個，其二聚體中不超過8個。


• 3'末端尤其重要，必須不含有與其他引子互補的序列，並且要與模板完全互補。

步驟   一般的PCR反應由20到35個循環組成，每個循環包括以下3個步驟：

1. 熔解：利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引子完全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘。


2. 降溫或稱接合：在DNA雙鏈分離後，降低溫度使得引子可以結合於單鏈DNA上。此階段的溫度通常低於引子熔點5℃。錯誤的黏合溫度可能導致引子不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。新技術的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會高於熔點3~5℃，僅需時間5~10秒。


3. 延長：DNA聚合酶由降溫時結合上的引子開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴於DNA聚合酶。該步驟時間依賴於聚合酶以及需要合成的DNA片斷長度。傳統的Taq估計合成1000bp大概需要1分鐘、較新的Tbr(來自於嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、融合型聚合酶僅約15秒。

聚合酶鏈鎖反應簡圖 (1) 96℃高溫下使雙股DNA打開 (2) 在約68℃下讓引子與DNA配對 (3) 在72℃ DNA延長 (P=聚合酶). (4) 第一循環完成，做出的兩段雙股DNA又可當作下一個循環模板，這樣每次循環都使得擴增的DNA片段加倍。

優化PCR   在實踐中，PCR可以因各種原因而失敗，部分原因是由於其對於污染的敏感性，導致擴增錯誤的DNA產物。正因為如此，人們已經開發了一些技術和步驟來優化PCR反應條件。將PCR反應前的混合物與潛在DNA污染物分開的實驗室方案和流程解決了外源DNA的污染問題。這通常包括從用於分析的區域分理出PCR的設定區域或者說PCR產物的純化，一次性塑料製品的使用，及對反應裝置之間的工作檯面徹底清潔。引子的設計技術在改善PCR產物產率和避免雜產物的形成是很重要的。替代緩衝成分和聚合酶的使用有助於較長或存在其他問題的DNA區域的擴增。在緩衝體系中加入試劑，如甲醯胺，或會增加PCR的特異性和產量。可以利用計算機模擬理論PCR結果（電子PCR），以協助在引子設計。

PCR的各種變體

• 遞減PCR(touchdown
  PCR)：前幾循環溫度逐漸下降。


• 逆轉錄PCR(RT-PCR)：以由mRNA逆轉錄而來的DNA爲模板，由此產生出來的DNA不帶有內含子(基因中不具意義的段落)，常應用於分子克隆技術。


• 熱啟動PCR(hot
  start PCR)：以高熱活化型核酸聚合酶進行反應，減少非專一性產物。


• 即時PCR(real-time
  PCR)：PCR過程中利用螢光探針或染料定量檢測，又稱定量PCR(quantitative PCR)。


• 巢式PCR(nested
  PCR)：先用低特異性引子擴增幾個循環以增加模板數量，再用高特異性引子擴增。


• 多重PCR(multiplex
  PCR)：在同一個管中使用多組引子。


• 復原條件PCR(reconditioning
  PCR)：PCR產物稀釋10倍後重新放入原濃度的引子和dNTP等循環3次，以消除產物中的異二聚體。


• dsRNA合成(dsRNA
  replicator)：合併使用high-fidelity
  DNA polymersae、T7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase；從雙股DNA轉錄為對應的雙股RNA(dsRNA)。可應用於RNAi實驗操作。


• COLD-PCR(co-amplification
  at lower denaturation temperature-PCR):用以檢測突變或特殊等位基因的PCR應用技術。


• Digital-PCR：將標準的PCR反應分割至每一個反應中僅1~2個copy。藉以偵測微小比例的基因差異。應用於：癌症突變基因、病原體檢測、藉由母血對胎兒做產前檢測。

PCR的應用

• 基因圖譜建立


• 親子鑑定


• 偵測遺傳疾病


• 複製特定基因


• 基因突變研究


• DNA遺傳演化


• 基因表現比較

鑒定基因 
人體內的細胞共有有約為30億個鹼基對的DNA，每個人的DNA會有差異，具有差異的鹼基對數目達幾百萬之多，因此通過分子生物學方法顯示的DNA圖譜也因人而異，由此可以識別不同的人。所謂「DNA指紋」，就是把DNA作為像指紋那樣的獨特特徵來識別不同的人。由於DNA是遺傳物質，因此通過對DNA鑒定還可以判斷兩個人之間的親緣關係。

親子鑒定-----

診斷遺傳病   PCR允許白血病、淋巴瘤