利用甲基磺酸乙酯和枯萎病菌毒素誘變篩選香蕉抗毒素突變體
摘要：以化學誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）和香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）4
號生理小種的粗毒素為誘變劑，以香蕉愈傷組織和分化芽為篩選材料，通過多步篩選法，優化了篩選體
系，並篩選出了抗香蕉枯萎病菌毒素的突變體。以體積百分比濃度為0.5%的EMS 分別處理香蕉愈傷組織
和分化芽40 min，獲得“半致死劑量”效應，對存活的香蕉愈傷組織和分化芽在依次遞增的粗毒素濃度
（5.0%→10.0%→12.5%）脅迫下進行定向篩選，獲得了抗香蕉枯萎病菌毒素的愈傷組織塊和分化芽，從
抗病分化芽突變體獲得了再生植株。對再生植株抗毒素的性能進行鑒定，其病情指數（24.72）顯著低於
對照植株（96.11），抗毒素效果達到74.28%。
關鍵字：香蕉；香蕉枯萎病菌；毒素；甲基磺酸乙酯（EMS）；抗病突變體；離體篩選
中圖分類號：S 668.1；S 436.67 文獻標識碼：A 編號：0513-353X（2012）08-1465-06
香蕉枯萎病[Fusarium oxysporum f. sp. cubense（E. F. Smith）Snyder et Hansen]是香蕉上的一種
土傳性的世界毀滅性病害。20 世紀50 年代，該病在中、南美洲的巴拿馬、哥斯大黎加、洪都拉斯、
哥倫比亞等地發生嚴重，毀滅了大片香蕉園（Jones，1999）。香蕉枯萎病現廣泛分佈于亞洲、非洲、
澳大利亞、南太平洋及熱帶美洲的各香蕉產區，給種植國帶來了巨大的經濟損失，是最嚴重和具毀
滅性的病害之一（Jones，1999；謝梅瓊等，2011）。近年來，香蕉枯萎病已成為中國香蕉產業發
展的最大障礙之一（謝梅瓊等，2011）。對於香蕉枯萎病這種土傳性的維管束病害的防治，目前尚
無理想的藥劑。選育抗病品種被認為是防治該病最經濟有效的措施之一（左存武等，2010）。利用
組織培養技術結合化學誘變技術、細胞工程技術來提高香蕉種質的抗病水準，是近年來生物技術在
香蕉抗病育種上的發展與應用（Bhagwat & Duncan，1998；Matsumoto et al.，1999；徐春香等，2008）。
Hwang 等（2004）利用組織培養技術，從香蕉組培苗的變異植株中選育出了抗香蕉枯萎病的新品種。
本研究在前期研究工作的基礎上（敖世恩等，2006a，2006b；唐倩菲等，2006a，2006b；黃永輝等，
2011；楊媚等，2012a，2012b），以化學誘變劑甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）和
香蕉枯萎病菌4 號生理小種的粗毒素為雙誘導劑，在離體條件下對香蕉組織進行定向誘變，旨在篩
選出抗香蕉枯萎病的突變體，創制香蕉抗病種質新資源，以保護香蕉產業的健康發展。
1 材料與方法
1.1 供試材料
本試驗於2010—2011 年在華南農業大學熱帶亞熱帶真菌研究室的實驗室和溫室內進行。供試
香蕉品種為巴西蕉。5 或6 葉齡香蕉組培苗由廣東省農業科學院果樹研究所惠贈。以通過間接和直
接器官發生途徑分別獲得的愈傷組織和分化芽作為篩選材料。供試菌株為香蕉枯萎病菌（F.
oxysporum f. sp. cubense）4 號生理小種菌株，分離自香蕉罹病植株，由華南農業大學熱帶亞熱帶真
菌研究室鑒定和保存。病原菌粗毒素的製備參考黃永輝等（2011）的方法。
1.2 抗病突變體的離體篩選
1.2.1 甲基磺酸乙酯（EMS）誘變處理
用滅菌蒸餾水配製體積百分比濃度分別為0.25%、0.50%和0.75%的甲基磺酸乙酯（EMS）（上
海勁馬生物科技有限公司，高純，99%）溶液，備用。
採取浸漬法（黃俊生等，1995）進行誘變處理。將已繼代增殖的愈傷組織切成邊長3 mm 左右
的小方塊，與分化芽一起浸泡在上述3 種不同濃度的EMS 溶液中，持續時間分別為20、40 和60 min，
以滅菌水代替EMS 作對照（濃度記為0）。處理結束後，香蕉材料用滅菌水沖洗4 ~ 5 次，再用滅
菌濾紙吸幹多餘水分，然後分別接種到繼代培養基（姚明鏡等，1994）上進行預培養。每瓶接種4
塊愈傷組織或4 個分化芽，9 瓶為一個處理，每處理3 次重複。培養14 d 後，觀察、記錄愈傷組織
和分化芽的存活情況，計算存活率。凡能在繼代培養基上繼續生長或在變褐組織上長出新鮮幼嫩組
織的計為存活。以3 個重複的平均值為觀察結果。存活率（%）=（存活數/接種數）× 100。
通過存活率計算，確定EMS 的半致死劑量（存活率50%），以半致死劑量的EMS 處理愈傷組
織和分化芽，然後將存活的愈傷組織和分化芽用於下一步的抗毒素突變體的篩選。
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1.2.2 抗毒素突變體的篩選
含毒素繼代培養基的製備：在繼代培養基（姚明鏡等，1994）中加入粗毒素溶液，使粗毒素
溶液的含量分別為5.0%、10.0%和12.5%，高溫高壓滅菌後備用，以不加粗毒素液的繼代培養基為
對照（濃度記為0）。採用逐步篩選法，即以逐步增加培養基中粗毒素濃度的方法篩選突變體。選
取經半致死劑量EMS 誘變處理並進行過預培養的健康、大小一致的愈傷組織和分化芽，分步培養
在上述含粗毒素和不含粗毒素液（對照，濃度為0）的繼代培養基上（趙蕾等，2001），成批地進
行“篩選→繼代→篩選”，3 次循環往復。每瓶接種4 塊愈傷組織或4 個分化芽，9 瓶為一個處理，
每處理3 次重複。每一次的存活組織進入下一輪更高濃度的粗毒素的篩選，最後挑選出存活的愈傷
組織和分化芽。經過擴繁後供植株再生和抗毒素鑒定試驗之用。
1.3 植株再生與抗毒素鑒定
將經EMS 和粗毒素雙重篩選存活下來的愈傷組織和分化芽進行植株再生，以未經處理的愈傷
組織和分化芽為對照，每瓶接種4 塊愈傷組織或4 個分化芽，9 瓶為一個處理，每處理3 次重複。
採用幼苗浸漬法（王家和等，2002）進行抗毒素鑒定。選取經過EMS 和粗毒素篩選的、大小
一致的再生幼苗（4 ~ 5 葉齡），移栽到盛有20 mL 12.5% 粗毒素溶液的50 mL 燒杯中，以未經EMS
和粗毒素篩選的再生幼苗為對照。每個處理設置10 個燒杯，每個燒杯種3 株苗，3 次重複。設置以
滅菌水代替毒素的空白對照。然後置於溫度（28 ± 1）℃，光照強度2 000 lx，12 h/12 h 光暗週期的
培養箱中培養。在處理後第7 天觀察、記錄發病情況並計算病情指數和抗毒素效果（敖世恩等，
2006a）。以3 次重複的平均值為觀察結果。
參考Brake（1995）的報導，觀察記錄葉片和整個植株的變色情況，病害程度分為5 級。0 級：
無黃化葉片，植株外觀健康；1 級：植株下部葉片可見輕微黃化；2 級：植株大部分下部葉片表現黃
化，新葉開始出現變色症狀；3 級：植株大部分或全部葉片表現大範圍黃化症狀；4 級：植株完全枯
萎，甚至死亡。病情指數= Σ（各級病株數× 代表數值）/（總株數× 最高病級代表值）× 100；
抗毒素效率（%）=（對照再生植株病指數–突變體再生植病情指數）/對照再生植株病情指數× 100。
2 結果與分析
2.2 抗毒素突變體的篩選
通過逐步增加粗毒素濃度（5.0%→10.0%→12.5%）的方法，使經過EMS 篩選的愈傷組織和分
化芽在含粗毒素培養基上繼代增殖，進行突變體的離體篩選，最後分別獲得了在12.5%粗毒素濃度
下穩定生長的愈傷組織94 塊和分化芽103 個。這些抗毒素的愈傷組織和分化芽即為抗枯萎病突變體。
經過擴繁後供植株再生和抗毒素鑒定。
2.3 再生植株的獲得
分別以上述經過EMS 和粗毒素篩選出的愈傷組織和分化芽（突變體）以及未經EMS 和粗毒素
處理過的愈傷組織和分化芽（對照）進行植株再生試驗。結果表明，上述對照的和突變體的愈傷組
織經分化培養，大部分愈傷組織都表現為褐變，只有少量綠點組織存活，但這些綠點組織也隨著再
生時間的延長而慢慢死亡，因此，對照的和突變體的愈傷組織未能獲得再生植株。而對照的和突變
體的分化芽經過培養都獲得了再生植株，其中對照獲得106 株再生苗，再生率為98.15%，突變體獲
得98 株再生苗，再生率為90.74%。當再生植株生長至4 ~ 5 片葉時，用於下一步的抗毒素鑒定。
2.4 再生植株的抗毒素鑒定
採用幼苗浸漬法對再生植株進行抗毒素鑒定，第7 天時的發病情況見表2。以滅菌水為空白對
照的上述兩類再生植株都不發病；經毒素處理後的突變體再生植株的病情指數比對照再生植株的病
情指數顯著下降，抗病效果顯著提高。具體表現為，對照再生植株表現嚴重萎蔫症狀，病級均達3
級以上，大部分為4 級，平均病情指數達96.11；而突變體再生植株的症狀不明顯，大部分植株的
病級在1 級以下，只有少數為2 級，平均病情指數只有24.72，與對照差異極顯著，抗毒素效果達
到74.28%。這些結果顯示，本研究中通過EMS 和粗毒素分步篩選法，已經篩選到能夠抗香蕉枯萎
病菌4 號生理小種粗毒素的再生植株。
3 討論
香蕉枯萎病這種土傳性的維管束病害被譽為香蕉“癌症”，雖然通過栽培和生防措施有一定防
治效果（姬華偉等，2012；李文英等，2012），但最經濟有效的措施是選育和利用抗病品種。由
於香蕉主栽品種均為三倍體，具高度不育性和單性結實等特點，難於通過傳統雜交育種方式獲得品
質好、抗性強的優良品種（徐春香等，2008），採用誘變育種是一條值得探索的新途徑。本研究中
以EMS 處理香蕉愈傷組織和分化芽，在獲得“半致死劑量”效應的基礎上，再在不同濃度的香蕉
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枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cubense）4 號生理小種粗毒素的脅迫下進行多步定向選擇，成功地篩
選到了抗毒素的香蕉愈傷組織和分化芽，並從抗毒素分化芽突變體中獲得了再生植株。這些抗毒素
的再生植株對病菌的抗性和在田間的抗性程度如何有待進一步研究。
對於突變體的離體篩選，如果使用單一的化學誘變劑，由於突變方向難以掌握，具有很大的隨
機性（安學麗等，2003）。因此，利用化學誘變劑結合病原菌毒素的選擇壓力來進行突變體的篩選，
可實現一定程度的定向誘變（Jain，2001）。本研究中結果取得了較好的誘變效果。
自從Carlson（1973）以病原菌的致病毒素為篩選壓力，建立抗毒素篩選體系以來，這一技術體
系目前已成為抗病突變體篩選最常用的體系之一。但Yoder（1980）認為病原菌毒素在致病過程中
是否起關鍵作用是保證利用毒素篩選出具有抗病性的突變體的必要條件之一。已有的研究結果表明，
香蕉枯萎病菌的粗毒素對香蕉具有明顯的致萎作用，是香蕉枯萎病的重要致病因數（許文耀等，
2004；楊媚等，2012a，2012b）。因而本研究利用毒素篩選的抗病突變體具有較大的實用價值。
Hartman（1984）認為，在病原菌毒素的選擇壓力下，植物易產生某些生理適應性變異體，一旦
選擇壓力消失，這些變異體又會恢復到原來的對毒素敏感狀態。而且毒素處理後只是少數細胞發生
突變，難以獲得穩定遺傳的抗病突變體。為了克服這些不足，在抗病突變體的篩選中採用多步定向
篩選法可能更有效（趙蕾等，2001）。本研究中採用逐步增加香蕉枯萎病菌粗毒素濃度的體系，成
功地篩選到了抗香蕉枯萎病菌毒素的突變體，證實了香蕉抗枯萎病突變體的篩選可採用多步定向法。__
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