“蘭花組織培養的新近技術”介紹 中興大學 生物系統工程研究室 陳加忠 在新加坡大學Hew博士所編著的” 產業相關之熱帶蘭花生理 “(Physiology of Tropical Orchids in Relation to the Industry”此書最後一章為蘭花組織培養的新近技術。此章內容不見得完全正確，但也代表著新加坡學術界對於蘭花種苗繁殖技術之瞭解。因此將此篇內容介紹如下： 一．簡介 由於Knudson氐非共生發芽法的發展完成，蘭花種子的發芽率廣泛地改進，也為蘭花組織培養鋪下了道路。到目前為主，蘭花各部位，例如根部、葉子、花芽、花梗等都可利用以進行繁殖，因此蘭花的栽培更快更容易。由於蘭花產業的需要，蘭花組培苗也成為重要的商品。然而商業化的蘭花組培苗生產仍然存在許多問題：幼苗生長緩慢，繁殖倍率低，容易玻璃質化，在健化期根部發育不良，死亡率高。因此由於優良品質的幼苗不容易得到，也限制了蘭花產業的擴展。蘭花產業需要低成長而且有效的微體繁殖技術以改善蘭花幼苗的繁殖倍率與品質。 此篇文章用以介紹蘭花組培苗在組培瓶內人為環境下的蘭花苗生理。近年來，培養基是否需要使用糖份引起了許多爭論。日本學者首先提出無糖栽培的論點，認為在強光低糖下植株將成長更好。而原先的高濕與含糖培養基抑制了光合作用。這些爭議在此文章中加以討論。
二．影響蘭花組培苗成長的因子 許多因子影響組培苗幼苗的成長，例如：培養基內碳源、礦物質、養份、荷爾蒙，光合作用有效能量、溫度、培養基酸醶值、相對濕度、組培瓶換換氣率、與微生物(真菌、細菌)。 近年來，利用環境控制以改善組培苗栽培情況逐漸受到了重視，可改善的環境因子包括光量、氣體環境、溫度與相對濕度。作物在自然環境下其氣體環境如下：氮78%、氧21%、二氧化碳0.035%，其餘為各種氣體。對於組培瓶內的氣體環境而言，與大氣有顯著不同。由於組培瓶往往保持氣密狀態，與外界氣體的交換量並不大，用以保持無菌以隔絕外界污染源。由於此種氣密要求，造成組培瓶內特殊的氣體環境。在商業生產上有許多種組培瓶與不同的瓶蓋或瓶塞，組培瓶的材料有玻璃、PC與PE等，用以隔離的瓶蓋(塞)則有棉花柱、螺紋瓶蓋、鋁箔紙、不透明膜等。不同的材料與形狀有不同的氣體透過率與光線透過率。 對蘭花組培苗生產而言，重要的影響因子如下： 1.糖份 在組培瓶內的植株與幼苗等其光合作用能力極低，因此碳平衡很難為正值(光合作用得到的碳源，比呼吸作用消耗的碳源較少)。組培苗生產需要提供額外的碳源(通常為糖)以供成長之用。此結果直接証明蘭花組培苗是屬於混營光合作用，同時利用空氣中的碳源與糖份所提供的碳源。以 進行的試驗中，顯示石斛蘭組培苗在三個月後，體內糖份 的含量比例與培養基中糖份 的比例相同。因此証實蘭花組培苗是利用培養基的糖份得到碳源，而無法以自身的光合作用能力得到淨碳源。 培養基中糖份的成份也是影響因子。許多種配方都是以葡萄糖為主要碳源。其他糖份例如葡萄糖與果糖對組培苗的成長影響並不相同。例如虎頭蘭在蔗糖中成長最佳，勝過其他麥芽糖、葡萄糖與果糖。也有研究顯示，虎頭蘭的原生體在含葡萄糖的培養基內生長受到抑制，然而萬代蘭培植體在無糖而具有椰子水成份的培養基內生長最佳，顯示其對高糖成份的培養基十分敏感，石斛蘭與Aranda組培苗喜好果糖勝於葡萄糖與蔗糖，如果培養基內蔗糖是唯一的碳源，則被水解成葡萄糖與果糖，葡萄糖先聚集在培養基內，在所有果糖被耗盡後才開始使用。對於石斛蘭組織而言，增加糖份濃度則增加其相對生長速率，尤其使用果糖最為顯著。雖然果糖証實是最好的碳源，但是在高壓高溫滅菌作業時其化學特性容易損壞，葡萄糖與蔗糖則無此問題，因此在大量生產時不適合使用。 在Aranda與石斛蘭組織的糖份吸收過程中表現為線性動力關係。根據Monod關係公式，糖份吸收率與最初糖份濃度有關。研究結果也顯示蘭花癒傷組織其細胞周圍層的糖份吸收率與糖份含量有關，Morel氏觀察虎頭蘭的PLB也有相同情形。蘭花癒傷組織的糖份吸收率由其表面積對體積的比值決定。在Aranda癒傷組織的研究中，顯示在含有葡萄糖的培養基內，葡萄糖的吸收率相當高。由其內部糖度比較結果，顯示葡萄糖的吸收率是其乾物質成長率的10-100倍。由此顯示葡萄糖在細胞內的累積率比其應用於成長的比率更多。 蘭花組織在不同成長階段對於不同的糖類有不同的親和性，因此要定出標準配方十分困難。培養基具有低糖量可避免細胞內累積過多的糖份。因此如果使用低糖份的連續液態培養基對於組培苗應該有幫助。 培養基內的糖份含量協助細菌與真菌的快速成長。因此組培瓶必須氣密與無菌以避免外在的污染源。在組培產業上，污染問題對組培苗生產有極大的影響。
2.二氧化碳 蘭花組培作業通常在密閉系統內進行，氣體交換率非常低，光周期時組培瓶內 濃度降到極低。在歐洲的溫室，冬天施加 用以增強作物的光合作用。近十年來，日本與韓國研究人員針對組培苗栽培，一直持續進行以 增加方式以促進生長的研究。在組培苗生長過程時持續的供應 ，使 維持足夠濃度，用以確保小植株生長時不受到 不足的影響。 在日本學者Kozai等人的研究，認為對多數非蘭科 作物，增加 可促進生長。虎頭蘭以花寶為培養基材料，證實增加 可促使 蘭花成長。而組培苗光合作用曲線為 ，光合作用能量與溫度的函數。 對CAM作物而言，其光合作用模式因個體的發展而改變。CAM蘭花的小幼苗主要以 反應為主，僅有低的CAM反應。在蘭株逐漸成長後，隨著組培苗栽培時間，CAM型光合作用逐漸增加。由於CAM作物中其 反應並不長，因此以 增加方式以促進組培苗成長的效果並不顯著。在Mokara white 組培苗的無糖栽培研究中，以三種處理進行比較：﹙1﹚1％ 、80 ，﹙2﹚1％ ，200 ，﹙3﹚10％ ，200 。結果顯示第﹙2﹚種處理有最大的乾物重，顯著地優於第﹙3﹚種處理。 3 .乙烯 蘭花組培苗在密閉的環境下成長，與外在環境的氣體交換率極低，因此組培苗成長時影響了組培瓶內在微氣候。組培瓶頂部空間乙烯累積時，其 與氧氣濃度迅速下降。乙烯的累積量除了受到植物成長時間的影響，其他影響因子包括使用培養基的種類與組培瓶的氣密性。乙烯對植物組織的影響有利與有弊。乙烯濃度的負面影響包括阻礙植物成長與促進老化。為了避免乙烯濃度過高，可使用Silver thiosulphate或 Silver nitrate，加於培養基內以減少乙烯產生。另一種方法是以通風裝置以增加氣體擴散能力以促進小苗生長。 已有研究顯示增加 可以阻礙乙烯的作用。由於 與乙烯的分子十分類似，因此 可做為與乙烯作用的競爭抑制劑。然而對整體的成長而言，以 與乙烯對抗並不完全有利。 4 .氮源 有許多研究顯示石斛蘭的組織與組培苗，對於 離子的吸收勝於N離子。嘉德利亞蘭體胚在發芽與生長初期無法吸收利用N離子，而在60天後才有能力使用氮離子。到現在為主，蘭花組培苗為何無法利用氮離子？此原因尚未清楚。 5.光強度 在密閉狀況的組培容器內，光強度通常為60 – 65 。以白色燈管而言，約為4800 – 5100 lux。在進行 施加栽培作業時，光量可增加至80 - 200 。有許多研究顯示在健化與大量繁殖階段增加 濃度與增大光量可促進生長。 6.光照方向 光線方向對蘭花成長的影響並無詳細報導。日本研究人員曾經試驗以側光促進組培苗成長並控制植株高度。此種方式最大的優點是採用方型GA-7組培瓶，瓶子可以採取推疊方式以節省空間。燈管置於組培瓶側面，因此組培苗照射的光線不受推疊影響。日本研究人員宣稱對馬鈴薯幼苗而言，側面照明的乾物種與葉面積比傳統對照值高1.8倍，底部的葉子較大，植株較短。日本另一種新近技術為利用光纖或LED進行給光。 7.其他因子 在密閉的組培瓶內，內部相對濕度為70 – 90％。當此種組培苗移植至外界，因為大氣較低相對濕度引起健化問題。組培瓶內的組培苗通常有較薄的角質層，氣孔發育不全，在移植至自然界後很難控制體內水分，因此容易脫水而死。面對此種高濕問題，可利用氣體透過膜加以改善。 氧氣對於蘭花組培苗的影響並未有研究報告。瓶內增加 濃度即相對減少氧氣濃度。減少氧氣濃度也可阻礙真菌與細菌的發展。氧氣濃度如果太低，呼吸作用也會受阻，這可能是減低氧氣濃度對組培苗帶來的好處。
三．蘭花組培技術的改進 日人Kozai教授認為組培苗體外（in vitro）栽培時，具有葉綠素的幼苗其淨光合作用速率低，主要原因是來自組培瓶內二氧化碳固定作業時，瓶內二氧化碳濃度太低。傳統栽培方法中，培養基內部的糖份會抑制組培苗自營光合作用。組培苗由於光合作用能力低，因此無法提供正值的碳平衡，因此需要補充糖份以做為碳源，而組培苗也因此進行混營光合作用。由於混營光合作用的結果，組培苗在健化期生長緩慢，死亡率高。近年研究證實具有葉綠素的組培苗具有光合作用能力，在自營光合作用情況下與適當的環境情況下，組培苗能夠有較高的成長率。 組培苗傳統有糖栽培方法的缺點如下所示： 1.培養基內所含糖份容易引起微生物污染(使無菌) 2.由於具有糖份，光能量對促進生長並不有效(有糖適光照) 3.必須使用小型且氣密的容器以降低污染損失(瓶對瓶) 4.組培瓶內空氣處於飽和狀態(通氣佳,室乾淨) 5. 與乙烯濃度可能增減至不利作物的程度(通氣佳,溫差) 6.經常需要使用荷爾蒙以促進生長(分段使用) 7.不正常的環境容易導致生理或型態異常，減緩生長， 增加變異程度(調整配方) 8.在健化期死亡率高，良品比例低(不健化) 9.很難使用電腦與機械手臂進行組培自動化作業(低工資國生產) (*可多點改善-使瓶苗更完美*) 日本研究者對上述問題的改善方式如下： 1.採用透氣膜 由於組培苗的生長受到組培瓶內氣體環境的影響，此種氣體環境可以增大通風量（氣體交換率）的技術加以改進。因此利用換氣以排除乙烯並引入外界的二氧化碳。透氣膜必須有高度透光性，低水蒸氣穿透性，不釋放化學物質，因此不影響組培苗的正常生長與發育。而且透氣膜必須能夠阻絕細菌與真菌的進入。 常用的透氣膜技術是在組培瓶周壁上穿孔，再貼上可耐高壓高溫殺菌的透氣膜（通常開口為0.5micro ）。 2.提供 有好多種方法可以提高外界 以促進光合作用。第一種方法將具有透氣膜的組培瓶放入生長箱內，生長箱再施給高濃度 。另一種方法係以空氣邦浦通氣方式直接將高濃度 以高壓加入組培瓶內，但是此種方法容易造成乾燥作用，使瓶內培養基失去水分變異。因此許多作物反而生長不良。 3.改變培養基 蘭花分生組織可在固體或液體培養基內栽培。介質再利用通風作業以促進生長。因此曾採用微孔PE膜以作為載具，將嘉德利亞蘭與Epidendrum種子加以播種，也可用以繁殖嘉德利亞蘭、虎頭蘭與石斛蘭的原生質，也曾用以栽培嘉德利亞蘭的幼苗。此種膜為親水性，在栽培蘭花組織時證實有顯著幫助，原因在於可以通風。日本研究者曾經將蝴蝶蘭幼株栽培於Rockwool介質，用以取代培養基，發現根系的發展優於傳統培養基。
四．增加 的優點 組培苗的品質指標可由瓶苗移植到自然界後可存活的比例加以評估。組培苗不利成長的現象可由 增加技術加以改善。其附加利益如下: 1.減少玻璃質化 在組培苗栽培由於玻璃質化引起了生理的異常。玻璃質化的原因包括相對濕度太高，提供過量的礦物質與碳源，植物荷爾蒙太高，光量太低等。組培苗的莖部變細，變得透明化，葉子過長，根系發育不良，氣孔發育不全等。葉片發育不正常，葉綠素不足。因此在健化過程存活率極低。組培瓶內相對濕度通常為90-100％，因此使組培苗產生更多的乙烯，而且使氣孔發育不全。 日本學者Kozai以 增加技術進行菊花組培苗試驗，由於大量通氣。因此瓶內相對濕度降低，組培苗比傳統栽培方式之苗株有更厚的表層腊質，更適當的氣孔發育，養份吸收更多。 2.改善發根狀態 傳統組培苗生產，發根階段的成本通常占所有成本的35％~75％。日本學者研究顯示在增加 的栽培作業中，發現根系發育更好，因此減少在田間健化的所需時間。 〈評論〉 此篇文章的內容幾乎來自新加坡與日本學者對於組培苗的研究論文。其中“無糖栽培技術”與“二氧化碳添加技術”是其強調重點。 組培苗無糖栽培技術在日本學界已進行十餘年。對於組培苗生產是否有用？無論日本學界發表多少篇研究，日本商業化生產組培苗的公司並無一家採用，更不用提及其他國家。無糖栽培與 施用技術至今仍然停留在日本與韓國的大學研究室。因為許多論文只有比較在不同處理下，各組培苗的最後葉面積與乾物重，對於組培苗成長過程無法觀察，更談不上對組培瓶內部微氣候的瞭解。以個人研究室之研究經驗看日本研究者對組培苗的研究結果，可以以“瞎子摸像”之故事加以比喻。如果無法看到組培苗生長的全部現象，則容易以一己之見自立學說，而其學說與實際並不相同，當然不能協助產業。此種學術研究與產業脫節的現象在台灣農業界也屢見不鮮。 組培苗的生理研究都牽涉到以下問題: 1. 培養基的糖份如何被組培苗吸收利用? 2. 組培苗如何在組培瓶內進行光合作用? 3. 組培瓶內微氣候如何變化? 4. 組培苗如何同時進行碳源固定與養份吸收？ 要瞭解各種栽培條件對於組培苗的影響，一定要進行組培苗的生理感測。中興大學生物系統工程研究室在組培苗的研究中即自“感測”與“建模”開始先開發各種感測器與感測技術，用以量測瓶內微氣候：包括溫度、光量、相對濕度、氧氣濃度與二氧化碳濃度。再推衍組培苗光合作用、呼吸作用與蒸散作用等三項生理作用的數學模式。而以模式計算結果與量測結果加以驗証後，以此建立組培苗栽培的最佳作業條件。這些研究結果已由組培業者應用於實際的生產線。 此篇文章係以由Hew教授所著書本第九章的內容說明日本與新加坡學者對組培技術的見解。美國與德國的研究界則對“無糖栽培”、“添加 ”、 “進行通風”等技術進行組培苗生長比較，得到反而是負面的結果。在生技產業中，研究論文與產業技術都有一段差距，主要的原因在於研究人員只考慮單一因子的影響而忽略了其他因子的重要性，但是組培苗的成長需求各因子相互配合。許多研究論文的研究結果並非一無是事，只是無法說明完整的事實。因此如何自一篇篇學術論文中汰蕪存菁，在於每個人對於組培苗研究領域功力的高低。
生物系統工程研究室在組培苗產業相關技術的研究結果已在此網站上加以介紹，詳細的技術內容因為涉及到國內蘭業產業的發展因此無法公開於網站。唯有以研習班或是現場討論方式，與組培業者共同解決組培苗栽培問題，這也是組培產業與研究人員互動的另一種特殊方式。
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