For :李x源 ..........................!!
酒類釀製是微生物複雜的作用過程，其中酵母菌扮演極重要的角色，傳統葡萄酒製作為藉由葡萄表皮上附著的酵母菌進行發酵，將葡萄酒醪中的糖類轉化成酒精，通常葡萄酒醪於發酵後3-4天，隨 S. cerevisiae 本 菌種進行發酵使酒精產生增加同時抑制其他野生菌種，此類酵母菌因酒精耐性較高，為酒醪發酵後期主要的菌類。不同種的釀酒用酵母菌由於生理生化特性不同，以 相同原料進行釀製後之葡萄酒產品風味亦會產生差異，因此由自然界廣泛篩選天然酵母菌以生產具有獨特風味特性的葡萄酒或發酵製品已成為食品界生產差異化產品 的手段之一。台灣的酒類產品過去為專賣制度，葡萄酒僅由菸酒公賣局製造或引進販售，同時葡萄此作物亦為引進栽培，因此不論在釀酒葡萄品種、釀酒用酵母菌種 類與釀製技術等各方面，台灣農民自產葡萄酒都難以與世界各重要葡萄酒生產區產品相比較。要產出具有台灣特色的葡萄酒須由上述育種、菌種或技術上改進，因此 本場由葡萄酒醪中篩選純化釀酒菌種，以作為酒類釀造可供之選擇。
要分離釀酒菌種首先需進行釀酒酵母菌之純化與鑑定，傳統上酵母菌鑑定是依據型態及生理特性，不同的培養條件易導致不確定性的結果，通常需有50-100 次的測試鑑定，才可達到種的鑑定層次。目前分子生物技術則成為重要的鑑定工具，其中PCR增幅微生物的特定序列為一普遍的技術，具有容易操作及高生產性， 而在可供鑑定分析的基因序列中，核糖體基因內轉錄間隔區(internal transcribed spacer, ITS)區域為常用的區域，其在研究基因的多樣性及種類鑑定上具有重要的價值。利用PCR方法增幅酵母菌ITS區域，可鑑識出屬間有差異性，種間及菌系間 則具有相同或相似分子大小，若以限制酵素如 Hin fI、 Cfo I、 Hae III進行分析，可進一步獲得種間專一性限制圖譜，同時酵母菌有性世代和無性世代具有相同的限制圖譜，可有效鑑別出不同的酵母菌種類。
本研究室以栽培於本場之倍利A葡萄發酵酒醪為來源進行酵母菌之分離與純化，在發酵後期由於酒精濃度提高，殘存於酒醪中之酵母菌推測應屬生產酒精之菌種 Saccharomyces cerevisiae ，在分離純化後並再培養用於葡萄酒之誘導發酵以了解其釀造之基本特性，作為進一步利用之參考，誘導發酵試驗之對照菌種使用Lalvin 2226 (Lalvin L2226, Lallemand inc., Montreal, Canada )。
二、葡萄酒自然發酵與菌株分離
上述採收於本場之倍利A葡萄以破碎去梗機進行破碎除梗後，添加液態果膠分解酵素0.07 g/kg (Rapidase TM Vino Super，RVS，泛球)，調整汁液糖度至25 。 Brix，總酸為0.8﹪以下，另添加偏亞硫酸鉀 (Potassium Metabisulfite，KMS)使酒醪中保持50 ppm二氧化硫開始發酵。葡萄酒自然發酵之處理於七天後進行殘存菌種之分離純化，取酒醪1 ml以無菌水序列稀釋後，再由稀釋液取100 μl塗抹於LB平板培養基上，待菌落長出後再次純化並選殖其核糖體基因內轉錄間隔區 (ITS)。
葡萄酒誘導發酵處理為將倍利A葡萄破碎去梗後分為16公升，四重複，酒醪置於20℃含皮發酵，添加先前試驗所純化之菌種或商業酵母菌 (Lalvin L2226)以供對照。於第七天進行壓榨去皮，分裝於玻璃桶中，玻璃桶瓶口並裝設發酵栓。不同發酵試驗處理之酒醪於不同時間取酒液離心，測定還原糖濃度及酒精度。
菌株分離方法為將取樣之發酵酒醪以無菌水序列稀釋後，各取100 m l塗抹於含有100 ppm鏈黴素 (streptomycin sulfate, sigma) 之YMA (0.3 % yeast extract, 0.3 % malt extract, 0.5 % peptone, 2 % agar, sigma ) 平板上，3日後計數菌落數，每一處理分離50個菌落培養於YEPD ( 1 % yeast extract, 2 % peptone, 2 % glucose, 2 % agar, sigma) 培養基，使用合成引子進行酵母菌ITS PCR增幅反應。進行ITS限制酵素片段多形性分析時取7 m l 的PCR產物，加入1 m l緩衝液及5單位限制酵素和1 m l dd H 2 O，在37℃下反應3小時，反應產品以3 %瓊脂膠電泳分離。確認為釀酒用酵母菌後即進行純化培養，如此可獲得需要的菌種。
三、篩選純化釀酒菌種之特性
本場利用前述技術所分離純化的酵母菌在發酵初期初步鑑定有八株，但其中僅一菌系屬於釀酒用的酵母菌，但在發酵末期僅有該釀酒用的酵母菌可以殘存。此菌株已被純化以作進一步鑑定及釀酒特性的鑑定。
由於葡萄表面具有各種不同的微生物，以自然發酵常導致每一批葡萄酒品質不穩定，因此商業釀酒一般均會接種大量優勢酵母菌以確保不同批次的產品均可達到品質一致。因此我們也比較了本純化菌種與商業菌種在發酵釀酒特性的差異，以了解本菌種作為商業釀造菌種的潛力。
試驗結果顯示不論是添加商業酵母菌或是本菌種誘導發酵之處理，其酒醪於第六日完成酒精發酵作用，還原糖量降至5 -6.35 g /L，酒精度達11.55-11.9 vol.﹪。相對的，不添加商業酵母菌以自然發酵處理之酒醪於第八日完成酒精發酵作用，還原糖量降至3.4 -5.5 g /L，酒精度達11-11.1 vol.﹪。由還原糖量降低及酒精生成結果顯示誘導發酵之酒醪可提前二日完成發酵作用，商業酵母菌添加處理可縮短酒精發酵時間，酒醪中添加偏亞硫酸鉀之處 理於還原糖降低及酒精生成上無顯著的差異。在製酒風味的比較上，我們發現用本菌種可有產生較濃郁的果香，但商業菌種L2226則香氣明顯較淡
四、結語
酵母菌( S. cerevisiae ) 於葡萄酒釀造中扮演重要角色，傳統酒莊通常使用篩選過之固定菌種來維持其產品獨特且穩定之風味，隨發酵技術的進步，目前普遍採用添加活性乾酵母菌進行酒類誘導發酵，以大量接種優勢酵母菌種 Saccharomyces cerevisiae ， 確保發酵過程可降低其他微生物污染，避免每批不同葡萄上微生物相之差異影響釀造的結果，有效控管發酵過程以獲得穩定且均一的品質。目前國內酒莊製酒多使用 國外進口的活性乾酵母菌種如Pasteur champagne即為分離自法國知名葡萄酒產區之菌系，國內如要發展具本土特色之葡萄酒應廣泛比較不同菌種對釀酒品質之影響。本場於葡萄表面所分離純化 之酵母菌經過初步基本釀酒特性之測定後發現，不但釀酒特性與一般商業菌種無顯著差異，並且在成品的風味上優於商業菌種，將來可為農村酒莊使用，開創其專屬 風味的葡萄酒。
--------------------------------------------------------------------------------------
1、傾注平板法
首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營養瓊脂培養基充分混合，然後把這混合液傾注到無菌的培養皿中，待凝固之後，把這平板倒置在恆箱中培養。單一細胞經過多次增殖後形成一個菌落，取單個菌落製成懸液，重複上述步驟數次，便可得到純培養物
2、塗佈平板法
首先把微生物懸液通過適當的稀釋，取一定量的稀釋液放在無菌的已經凝固的營養瓊脂平板上，然後用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地塗佈在培養基表面上，經恆溫培養便可以得到單個菌落。
3、平板劃線法
最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環取培養物少許在平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。當接種環在培養基表面上往後移動時，接種環上的菌液逐漸稀釋，最後在所劃的線上分散著單個細胞，經培養，每一個細胞長成一個菌落。
4、富集培養法
富集培養法的方法和原理非常簡單。我們可以創造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。所創造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養基和培養條件下，經過多次重複移種，最後富集的菌株很容易在固體培養基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。通過多次重複移種便可以得到純的寄生菌。
5、厭氧法
在實驗室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養基的試管作為培養容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數分鐘，以便逐出培養基中的溶解氧。然後快速冷卻，並進行接種。接種後，加入無菌的石蠟於培養基表面，使培養基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種後，利用N2或CO2取代培養基中的氣體，然後在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種於培養基上，然後再把培養皿放在完全密封的厭氧培養裝置中。
留言列表
