文／楊嘉慧
審稿／中央研究院細胞與個體生物學研究所臨海研究站助研究員 陳志毅
螢光魚家族變大了
台灣的基因轉殖螢光觀賞魚在國際間已負盛名，自從2001年首度發表小型螢光觀賞魚後，經過九年才成功使中型觀賞魚發出綠色螢光。中型螢光觀賞魚比小型螢光觀賞魚的研發難處在哪裡？台灣螢光觀賞魚技術近 10 年來領先全球，繼 2001 年首度發表體長約 4
公分的斑馬魚、稻田魚等小型螢光觀賞魚後，今年，又發表體長約 12 公分中型螢光觀賞魚，讓九間波羅魚及神仙魚發光了。怎麼讓魚發光？螢光魚是結合基因轉殖、育種等技術，所研發出來的基因改造動物。培育一條螢光魚，首先得將螢光蛋白的基因（外來基因片段）接在一段啟動子後面，接著利用顯微注射、電破法等，迫使外來基因進入魚類受精卵內。一旦轉殖成功，經過選種及育種，選出螢光蛋白在魚體表達最亮的個體，進而再次選種與育種，就可以選殖出在魚體肌肉細胞表現螢光的個體。要讓螢光魚全身發出螢光，或只在特定部位發光，必須選擇不同啟動子。啟動子會讓基因表現，經由轉錄及轉譯作用形成蛋白質。假設螢光蛋白是連接在僅於心臟表現的啟動子，轉殖成功後，只有魚的心臟會發出螢光；若要讓整條魚發光，必須使用在全身均會表現的啟動子，如骨骼肌啟動子。
九間波羅魚身上有深色條紋，因此必須藉由育種及基因轉殖法並行，讓九間波羅魚的條紋變淡，使發出的螢光效果更佳。（影像來源：林育禾）
右上為未轉殖的神仙魚，主圖為轉殖GFP基因（綠色螢光）的神仙魚。（影像來源：林育禾）
把綠色螢光GFP基因接在選定的基因之後，該基因若有表現，螢光蛋白也會表現。（電腦繪圖：楊嘉慧）優生育種，增加抵抗力中央研究院細胞與個體生物學研究所臨海研究站助研究員陳志毅表示，不同魚種的骨骼肌啟動子均不一樣，因此目前成功讓小型稻田魚及斑馬魚的螢光蛋白表現量高的啟動子，並無法在九間波羅魚或神仙魚表現出一樣亮的效果，所以需要針對不同魚種，尋找讓螢光蛋白表現量高的啟動子。此外，深色斑紋會使螢光效果大打折扣，研究人員還必須藉由育種，挑選基因突變、斑紋變淡的個體彼此交配，再從子代中選擇膚色最淡的進行交配，反覆幾次，才能使斑紋變淡，讓螢光轉殖魚看起來夠亮。
九間波羅魚轉殖過程：(1)未轉殖魚身上有九道黑色斑紋；(2)轉殖魚的深色斑紋使螢光效果大打折扣；(3)挑選斑紋變淡的個體彼此交配，進行數代後，就能使斑紋變淡，讓螢光轉殖魚看起來夠亮。（影像來源：林育禾）
生技業者芝林公司負責人林育禾表示，現在轉殖成功的九間波羅魚及神仙魚的身體抵抗力及健康情況都相當不錯，因為育種過程會將帶有不良基因的魚種剔除。另外在轉殖過程中，也特別將抗菌蛋白基因接在同一個啟動子上，讓螢光魚更容易養殖。不過，目前研發的中型螢光觀賞魚還無法上市，因為得先讓螢光魚不孕並做田間試驗，確保基因轉殖魚不會繁殖或無法在野外生存，以免影響自然生態。成功讓中型螢光魚發光的祕密早在九年前，科學家就找到讓小型魚全身發光的秘訣，然而，一直等到 2010 年，中研院細胞與個體生物學研究所臨海研究站與芝林公司才突破關鍵技術，讓九間波羅魚及神仙魚這類中型魚發光。中型魚比小型魚難以進行基因轉殖的原因之一，是小型魚從卵到成熟期只要 2~3 個月，可以很快得知轉殖進去的基因有無修飾的必要，或啟動子的選擇是否正確；但是中型魚卻需要 8~12 個月。中型魚的排卵時間不能控制，也增加轉殖的難度。陳志毅表示，一開始他們是以顯微注射法，將外來基因鑲嵌進九間波羅魚的染色體內，但注射時間必須在受精卵分裂前（約排卵後 30 分鐘之內）。小型魚每天都會排卵，且可以利用光週期控制排卵時間，轉殖時間很好拿捏；但中型魚不會每天排卵，也無法利用光週期控制排卵，研究人員常常錯失適當的轉殖時間，最後只好 24 小時輪流守在魚缸旁。利用顯微注射法，還有一個困難在於魚卵外包圍著一層硬卵鞘，中型魚的卵鞘比小型魚厚，注射長針極細（直徑 0.1~0.5 微米），穿透卵鞘屏障時容易斷裂。於是在做神仙魚試驗時，芝林公司負責人林育禾嘗試使用生殖巢電穿孔轉殖法，利用瞬間高壓電使細胞膜形成孔洞，再將外來基因送進生殖巢內。此法的優點是不需精密的轉殖技術，且受精之前即可轉殖，免除守在魚缸旁等待排卵的工作，但缺點是轉殖成功率比顯微注射低。
以生殖巢電穿孔轉殖法將外來基因置入生殖巢內的細胞中。（影像來源：林育禾）
由於運用不同轉殖方法及長時間的實驗，研究人員經過六年研究，終於讓九間波羅魚及神仙魚全身發出綠色螢光。未來，他們會持續研發大型螢光觀賞魚，讓生長期更長的大型魚也能發光，使台灣基因轉殖水產生物產業在國際市場更具競爭力。
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