順鉑（Cisplatin，CDDP）是一種含鉑的抗癌藥物，即順式-二氯二氨合鉑(II)，棕黃色粉末，屬於細胞周期非特異性藥物，對肉瘤、惡性上皮腫瘤、淋巴瘤及生殖細胞腫瘤都有治療功效。它是一大類鉑類藥物中最早被合成的一個，結構最簡單且作用機理明確，它的發現又導致了其他抗癌藥物的研製，包括卡鉑、奧沙利鉑、奈達鉑及賽特鉑等。
張淑華等―台灣紅豆杉之細胞培養 經調查發現，除了太平洋紫杉，紫杉醇也存在其他紫杉屬植物的各部分組織中，其含量因不同樹種、單株、組織，甚至栽植環境而異，最高含量約為乾重的0.01-0.045% (Jaziri et al. 1996, Ho et al. 1997)。目前紫杉醇之主要來源為紫杉屬植物的樹皮與枝葉萃取物，由於受限於含量低，加上紫杉屬植物生長緩慢，因而無法大量生產提供製藥需求(Cragg et al. 1993)。紫杉醇的全合成方法雖已完成，但由於步驟多，且收率低，而無法達到商業化生產之目的(Nicolaou et al. 1994)；利用組織培養生產紫杉醇被認為是一種深具潛力的方法，最近相關研究報告很多。除了基本細胞培養方法的建立(Fett-Neto et al. 1994, Wickremesinhe and
Arteca 1994, Ketchum and Gibson 1996)以外，也有許多研究探討改變培養基組成或培養方法以提高紫杉醇或紫杉烷類化物的產量；目前較有效的方法有：以不同種類糖的組合來取代一般培養用的蔗糖培養細胞或在培養過程中添加糖類(Hirasuna et al. 1996, Ketchum and Gibson
1996)或methyl jasmonate (Ketchum et al. 1999,
Yukimune et al. 2000)，改變氣體組成並以methyl jasmonate誘導(Mirjalili and Linden 1996, Phisalaphong and Linden
1999)，或提高培養溫度(Choi et al. 2000)等，都可以增加紫杉醇產量。雖然有關紅豆杉的細胞培養研究報告相當多，但針對台灣紅豆杉細胞培養的研究不多，Ma等(2002)發現紫杉醇含量在細胞自然死亡(apoptotic cell death)時可達最高( 14.2 m g/L)；Yuan等(2001)在培養基中添加吸附劑與前驅物可使紫杉醇由3.4 mg/L增加5倍達16.7 mg/L。本試驗研究目的在建立台灣紅豆杉細胞培養方法，並比較不同來源細胞生長與紫杉醇含量差異，以提供作為進一步紫杉醇誘導試驗之依據材料與方法一材料實驗材料有台灣紅豆杉的胚體、胚培養苗及成熟樹葉片。胚來自層積保存於4℃的種子，胚培養苗的培育方法請參考我們先前發表之報告(Chang and Yang 1996)，成熟樹葉片則採集自中橫的台灣紅豆杉天然母樹。
二、癒合組織誘 以胚、6個月大無菌胚培養苗之葉片、及成熟樹葉片誘導癒合組織。無菌苗葉片不需消毒，種子與成熟樹幼嫩葉片，則經酒精與次氯酸鈉消毒，並以無菌水清洗後，切開種皮與胚乳取出完整胚，葉片則切成約0.5×0.5 cm2大小，培養於WPM基本培養基(Lloyd
and McCown 1981)內含30 g/L蔗糖，2 mg/L NAA (naphthaleneacetic acid)或5 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)，0.8
g/L PVP (polyvinylpyrrolidone 40000)，0.1
g/L casein hydrolysate (CH)，100 mL/L coconut milk (CM)等誘導癒合組織，詳細培養方法可參考我們已發表之報告(Chang et al. 1996)。癒合組織培養於溫度為25±2℃之黑暗培養室，每4-5週定期繼代培養一次.三、細胞培養選已培養2年之5種不同來源的癒合組織(細胞系A-E)進行細胞培養試驗。細胞系A與B誘導自胚，細胞系A生長佳，細胞顏色白且結構鬆軟；細胞系B生長速率中等，為黃棕色之瘤狀組織(nodule)；細胞系C與D分別來自成熟樹葉片與莖段，細胞系E源自試管苗葉片，三個細胞系約為生長中等，顏色介於黃到棕色，細胞鬆軟偶有瘤狀組織。分別秤取鮮重5 g之癒合組織培養於含60 mL培養基的250 mL三角瓶中，培養基為WPM基本培養基添加30 g/L蔗糖，0.1 g/L CH，100 mg/L CM(簡稱W培養基)，與2 mg/L NAA(W培養基＋2 mg/L NAA，簡稱WN培養基)，每兩週繼代培養一次。繼代培養方法為取出1/2 (30 mL)不含細胞之培養液後加入等量新鮮WN培養基，培養一個半月後進行細胞生長試驗。(一)不同生長激素對台灣紅豆杉細胞生長的影響以1個半月大之台灣紅豆杉A-E共5個細胞系進行試驗，培養基為W培養基添加2、5 mg/L
NAA或5 mg/L 2,4-D。細胞起始密度為100 g·FW/L (FW=fresh
weight)，新舊培養液比例為1:2.5。方法為將A-E細胞之培養液以(Miracloth Calbiochem, La Jolla, CA)過濾，分開細胞與培養基(此培養基稱之為舊培養基)。分別秤取2 g鮮重(FW)的細胞，置於50 mL三角瓶，加入舊培養基至體積為6 mL，再加入15 mL新鮮配好培養基，培養液總體積為21 mL。培養21 d後，將培養液過濾後秤量細胞總鮮重。(二)不同細胞系之紫杉烷類(taxane)含量的測定將A-E五個細胞系以細胞密度為100 g·FW/L，培養基為WN，新舊培養液比例為1:2.5，總體積為21
mL，以50 mL三角瓶培養，細胞秤取與培養基定量方法同上(一)所述。培養21 d後，將培養液過濾，收集細胞與培養基，分開萃取並測量taxanes含量。細胞先以液態氮冷凍後，置於冷凍乾燥機去除水分，以10 mL甲醇(methanol)在超音波震盪器中萃取30 min，置入離心機以1000 xg離心5 min後收集上清液，沈澱物再以methanol萃取1次，將2次萃取液合併備用。培養基以二氯甲烷分液萃取，有機萃取液以旋轉型蒸發器(rotary evaporator, Eyela)減壓濃縮乾燥，再以1.5 mL甲醇溶解，用0.2 μm濾膜(AcrodiscR Lc 13 PVDF)過濾後，取10 μL溶液以高效能液相層析儀(HPLC, Series 200L c
pump, Perkin-Elmer Co.)，經光電二極體偵測器 ( 235c Diode
Array Detector, Perkin-Elmer Co.)分析。所使用的管柱為Lichrospher RP-18 (250×4 mm, particle size: 5 μm, endcapped, Merck Co.)，移動相(mobile phase)之沖提溶液組成為methanol：acetonitrile：H2O = 20:38:42，流速為1 mL/min，偵測波長為230 nm (Ho et al. 1997)。紫杉醇(簡稱TX)、10-去乙醯巴卡亭III (10-deacetyl baccatin III，簡稱DB)，與巴卡亭III (baccatin III, 簡稱BC)等三種紫杉烷標準品購自Sigma Company。(三)細胞接種之起始密度對台灣紅豆杉細胞生長的影響一個半月大之台灣紅豆杉細胞系D培養液以Miracloth過濾，分別秤25, 50, 100, 150, 200 g鮮重細胞，置於1 L培養基中進行試驗，其中細胞密度為25 -100 g ·FW/L的試驗，將秤好之細胞放入量筒，加入舊培養基至體積為18 mL，再加入新鮮配好之WN培養基45 mL，使總培養體積為63 mL，新舊培養液比例為1:2.5；細胞密度為150與200 g·FW/L之試驗，由於細胞較多，因此將細胞加舊培養基體積增加為24.8
mL，新鮮WN培養基減為37.2 mL，兩者比例為1:1.5，總體積也定量為63 mL。將定量好之培養液倒入具有15 mL側支量管的250 mL三角瓶，進行細胞接種密度試驗。每3 d測量一次體積，測量時，旋轉三角瓶使細胞均勻懸浮後，小心將15
46 張淑華等―台灣紅豆杉之細胞培養 (四)繼代培養新舊培養液比例對台灣紅豆杉細胞生長之影響以細胞系D作為試驗材料，細胞起始接種密度為50 -150 g ·FW/L，細胞秤取後加入不等比例之舊培養基及新鮮WN培養基組合成總體積為20 mL培養液，培養於50 mL三角瓶，方法同上(一)所述，培養21 d後記錄細胞體積並觀察培養液顏色。(五)細胞連續培養(continuous culture)方法之建立以細胞系D為材料，細胞接種起始密度為25、50或75 g·FW/L，分別秤取所需細胞後加入舊培養液至90 mL，再加入210 mL新鮮的WN培養基使總培養液體積為300 mL，倒入1-L三角瓶中培養，共培養60 d。在培養的第15, 30與45 d取出三角瓶，將三角瓶傾斜50o角靜置25 min後，細胞團會因重力沈澱在下方，小心吸出上面不含細胞的舊培養基，在第15和30 d時吸出150 mL，在第45
d時因細胞體積增加，只取出100 mL舊培養基，取出培養基後，立刻加回等體積之新鮮WN培養基，再將三角瓶放回震盪器中培養；培養期間每3 d取出5
mL培養液，靜置20 min，待細胞沈澱後記錄體積，再放回原培養瓶中繼續培養。以上試驗所使用的培養基，以1 N KOH或HCL將pH值調整為5.7±0.05後，經121℃，1.05 kg/cm2大氣壓高溫高壓消毒15 min。所有的細胞培養試驗，均以三角瓶培養，三角瓶置於轉速為100
rpm之旋轉式震盪器，培養於溫度為25±2℃之黑暗培養室。每個試驗都重複3次。(續二)
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