分離純化紫杉醇的方法....!!!!
http://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB3273425.htm
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性狀：白色無臭無味的結晶或粉末，不溶於水，易溶於丙酮、氯仿、乙醚等有機溶劑。1963年美國化學家瓦尼（MC Wani）和沃爾（Monre E. Wall）首次從一種生長在美國西部大森林中稱謂太平洋杉（Pacific
Yew）樹皮和木材中分離到了紫杉醇的粗提物。在篩選實驗紅豆杉中，Wani和Wall發現紫杉醇粗提物對離體培養的鼠腫瘤細胞有很高活性，並開始分離這種活性成份。由於該活性成份在植物中含量極低，直到1971年，他們才同杜克（Duke）大學的化學教授姆克法爾（Andre T. McPhail）合作，通過x-射線分析確定了該活性成份的化學結構——一種四環二萜化合物，並把它命名為紫杉醇（taxol）。
1971年在紅豆杉中發現紫杉醇，發現抗癌機理獨特。
1992年美國政府將專利轉讓給施貴寶，紫杉醇面世。
1994年紫杉醇創世界抗癌藥物全球銷量冠軍。
2000年紫杉醇銷量創百億（後受原料供應未有進一步上升）
2002年中央發文嚴禁砍伐野生紅豆杉，鼓勵人工種植。
2004年施貴寶專利到期，全球更多藥廠介入紫杉醇生產。
2004年華源開始運作紅豆杉項目並籌建直屬紫杉醇提煉加工廠，目標成為：中國乃至亞洲最大紅豆杉基地。
2005年中央再次發文，全國普查紅豆杉資源，鼓勵種植。
2005年此項目接受個人投資者投資。
迄今為止，國際市場上只有2種紫杉醇原料藥：一種來自各种红豆杉樹皮；另一種是從歐洲觀賞紫杉枝條裡提取出“10-漿果赤黴鹼”，然後再經半合成而成，即多西他賽（多烯紫杉醇），其結構與天然提取紫杉醇十分相似。這兩種原料藥均為國際醫藥市場上的暢銷原料藥產品，並長期處於供不應求狀態，據有關部門估計，紫杉醇原料藥與多烯紫杉醇原料藥的銷量之比大約為10:1。在美國，紫杉醇注射劑（商品名：Paclitaxel）主要由百時美施貴寶獨家生產，現已有大約二三家製藥企業生產紫杉醇原料藥和製劑，但該市場基本上為百時美施貴寶所壟斷，其它幾家企業生產的紫杉醇製劑銷售額合計隻及百時美施貴寶的一個零頭。而多西他賽原料藥和製劑則主要由法國普朗克公司以及英國、意大利等幾
家公司合作生產，以普朗克的產量最大。紫杉醇在世界各國均為醫院首選的抗腫瘤藥物。近幾年來世界各國的腫瘤發病率比10年前已提高近一倍，肺癌、乳腺癌和卵巢癌等惡性腫瘤也呈多發趨勢，這些癌症病人均為紫杉醇的主要使用者。從總體上看，在沒有一種植物抗癌新藥能取代其位置之前，紫杉醇的銷量只會上升，不會下降。據世界衛生組織發布的最新數字，美國現已成為世界第一癌症高發國，其每年新增癌症病例140萬人，約佔當年全球癌症病人的14％。美國至今仍為紫杉醇最大消費國。隨著美國癌症發病率的提高，紫杉醇作為抗晚期惡性腫瘤的主要藥物，可以相信，其銷量將繼續保持快速上升勢頭。美國和其它發達國家在十幾年來的臨床使用過程中早已總結出一套紫杉醇與其它抗癌藥物的各種最佳配伍方案，其醫療部門已離不開紫杉醇這一“中堅力量”，因此，對於紫杉醇原料藥的需求量也會呈水漲船高之勢。江蘇紅豆集團已於三四年前投資數千萬元在華東地區建起了最大的紅豆杉速生林基地，總面積達7400畝，現人工栽培的紅豆杉樹苗早已鬱鬱成林，並得到聯合國有關部門的好評和國內林業部領導的高度讚揚。預計今年紅豆集團將開工生產紫杉醇原料藥和注射劑，設計年產600萬支紫杉醇注射劑，該項目已通過國家藥檢局和省、市藥監局的驗收。另外，我國東北林區以及雲貴兩省一些山區也在大力發展紅豆杉速生林栽培技術，在今後3~5年內，這些地方的有望形成新的紅豆杉林區，從而為國內提供寶貴的紫杉醇原料藥新來源。湖南、湖北等南方山區省也在建設紅豆杉栽培基地，作為幫助當地農民脫貧致富的措施之一。按這一發展趨勢，今後幾年我國紫杉醇原料藥年產量有望超過100公斤大關，從而成為世界主要紫杉醇原料藥和製劑的生產大國。
它包括ａ、萃取，以紅豆杉為原料獲得含有紫杉醇的提取物；ｂ、去除膠質，除去提取物中的膠質雜質；ｃ、分離純化。其特徵在於：紫杉醇生產工藝如下：
紅豆杉樹皮粉碎（越細越好），８５％～９５％酒精（料液比是多少？）３５－５５℃熱回流浸提三次（每一次需要多少時間？），５０－７０℃真空減壓濃縮至熱測比重１．１～１．２ｇ／ｍｌ，氯仿萃取，萃取液濃縮成膏狀，得紫杉醇含量１％氯仿膏，將紫杉醇含量１％氯仿膏加氯仿溶解完全，加矽膠攪拌均勻，涼乾，過篩，填裝到層析柱中，氯仿－甲醇梯度洗脫，ＴＬＣ檢測，分段合併濃縮，得紫杉醇含量５～８
％半成品，將紫杉醇含量５～８％半成品加丙酮溶解完全，加矽膠攪拌均勻，涼乾，過篩，填裝到層析柱中，丙酮－石油醚梯度洗脫，ＴＬＣ檢測，分段合併濃縮，得紫杉醇含量２０～２５％半成品，用丙酮－石油醚系統結晶３～４次，抽濾，５０℃真空減壓乾燥，得紫杉醇含量７５～８０％半成品，１６Ｍｐａ壓力層析分離，ＴＬＣ檢測，分段合併濃縮，目標段濃縮物丙酮－石油醚結晶，抽濾，乾燥，得紫杉醇含量≥９９．５％成品； 去除膠質的過程為：高壓矽膠層析柱層析去除膠質，同時將紫杉烷化合物分離為紫杉醇、三尖杉寧鹼、７－表紫杉醇３部分。
由紫杉樹皮、木質根部、樹葉、嫩枝和幼苗中分離提純的天然產物，含量以樹皮中最高。紫杉在中國植物學誌中的學名為紅豆杉，植物分類歸裸子植物亞門，松杉綱，紫杉目，紅豆杉科，紅豆杉屬。紅豆杉科含5屬23種，我國有4屬12種和1變種，分別為西藏紅豆杉或喜馬拉雅紅豆杉(Taxus wallichinanaZucc.)，雲南紅豆杉(Taxus
yunnanensis)，南方紅豆杉(Taxus chinensis vat． Mairei)和東北紅豆杉(Taxus cuspidata)。分佈在西藏、雲南、貴州、四川、廣西、廣東、湖南、湖北、江西、福建、浙江、安徽、河南、山西、陝西、甘肅和吉林山區。由紅豆杉屬植物的樹皮或樹葉中提取。紅豆杉樹皮或樹葉陰乾，磨細後，和95%乙醇提取。提取液濃縮至乾，剩餘物用水和二氯甲烷混合攪拌。靜置分出有機層，水層用二氯甲烷提取多次。提取液和有機層合併後，濃縮至乾。剩餘物溶入醋酸乙酯-甲醇(3：1)，和新鮮矽藻土拌和後，減壓蒸除溶劑。剩餘的粉末進行快速柱層析，先用己烷洗，後用二氯甲烷洗脫。收集後者，減壓蒸去二氯甲烷。剩餘物溶於醋酸乙酯，用70套(每套3～4根)裝有矽膠的中壓快速色譜柱進行層析，用不同配比的己烷-丙酮洗脫。收集含產物的組分，濃縮。剩餘物再經裝有矽膠的中壓快速色譜柱純化，用不同配比的甲醇-二氯甲烷洗脫。收集含產物的組分，減壓濃縮至於。剩餘物再經製備型高效液相色譜儀分離，得到的產物再用含水甲醇重結晶2次，即得紫杉醇純品。產率：樹皮0.028%，樹葉0.0088%。收率：樹皮93.3%，樹葉88%。熔點212～214℃，[α] D 20 -49°(1%，氯仿)。中國紅豆杉莖皮經粉碎，陰乾後，用1％檸檬酸水溶液浸泡24h後開始滲漉。用二氯甲烷萃取滲漉液，萃取液乾燥後，濃縮，真空抽乾。用矽膠進行2次柱層析，收集的流出液中含有紫杉醇和三尖杉寧鹼。基於它們側鏈結構的不同，把它們溶於四氯化碳中加溴，只對三尖杉寧鹼進行溴化，再經矽膠柱層析，可得只含紫杉醇的流出液，經處理後，得紫杉醇精品，含量99.19%，收率4.5×10 -5，回收率70%。
一種高效分離純化紫杉醇的方法名稱:一種高效分離純化紫杉醇的方法申請（專利）號: CN200610047378.2申請日: 2006.08.03 公開（公告）號: CN101020671公開（公告）日: 2007.08.22
主分類號: C07D305/14(2006.01 )I範疇分類:
分類號: C07D305/14(2006.01)I 優先權: 申請（專利權）人:瀋陽天峰生物工程技術有限公司地址: 110000遼寧省瀋陽市於洪區姚家村發明（設計）人:雷茂林;王繼文;趙餘慶;姜彬惠;周鑫宏;楊曉光國際申請: 國際公佈: 進入國家日期: 專利代理機構:瀋陽傑克知識產權代理有限公司代理人:李宇彤分案申請摘要: 本發明涉及一種高效分離純化紫杉醇的方法，它具有工藝簡單、產物回收率高的特點。高效分離純化紫杉醇的過程為：萃取，去除膠質，分離純化。去除膠質的過程為：高壓矽膠層析柱層析去除膠質，同時利用丙酮-石油醚系統結晶，將紫杉烷化合物分離為紫杉醇、三尖杉寧鹼、7-表紫杉醇3部分。將提取物為紫杉醇含量為5-25％的樣品，高壓矽膠層析柱層析，以乙酸乙酯一環己烷洗脫，目標物紫杉醇段餾分濃縮乾燥，丙酮—石油醚結晶3次，抽濾，50℃ 真空減壓乾燥得到純度為65％的紫杉醇，紫杉醇收率達到80％。本發明為大批量製備紫杉醇提供了一種工藝簡單方便、產物回收率高、成本低廉的新方法。使用本方法製備的紫杉醇含量≥99.5％、三尖杉寧鹼含量為0.15％、7-表紫杉醇含量為0.10％。主權項:
1、一種高效分離純化紫杉醇的方法，它包括a、萃取，以紅豆杉為原料獲得含有紫杉醇的提取物；b、去除膠質，除去提取物中的膠質雜質；c、分離純化；其特徵在於：紫杉醇生產工藝如下：紅豆杉樹皮粉碎，85％～95％酒精35 -55℃
熱回流浸提三次，50 -70℃ 真空減壓濃縮至熱測比重1.1～1.2g/ml，氯仿萃取，萃取液濃縮成膏狀，得紫杉醇含量1％氯仿膏，將紫杉醇含量1％氯仿膏加氯仿溶解完全，加矽膠攪拌均勻，涼乾，過篩，填裝到層析柱中，氯仿-甲醇梯度洗脫，TLC檢測，分段合併濃縮，得紫杉醇含量5～8％半成品，將紫杉醇含量5～8％半成品加丙酮溶解完全，加矽膠攪拌均勻，涼幹，過篩，填裝到層析柱中，丙酮-石油醚梯度洗脫，TLC檢測，分段合併濃縮，得紫杉醇含量20～25％半成品，用丙酮-石油醚系統結晶3～4次，抽濾，50℃ 真空減壓乾燥，得紫杉醇含量75～80％半成品，16Mpa壓力層析分離，TLC檢測，分段合併濃縮，目標段濃縮物丙酮-石油醚結晶，抽濾，乾燥，得紫杉醇含量≥99.5％成品；去除膠質的過程為：高壓矽膠層析柱層析去除膠質，同時將紫杉烷化合物分離為紫杉醇、三尖杉寧鹼、7-表紫杉醇3部分。使用本方法製備的紫杉醇含量≥99.5％、三尖杉寧鹼含量為0.15％、7-表紫杉醇含量為0.10％酒精氯仿萃取氯仿溶解氯仿-甲醇梯度洗脫丙酮溶解氯仿-甲醇梯度洗丙酮溶解丙酮-石油醚梯度洗3～4次抽濾50℃真空減壓乾燥16Mpa壓力層析分離丙酮-石油醚結晶紫杉醇含量≥99.5%成品高壓矽膠層析柱層析去除膠質紫杉烷化合物分離為紫杉醇、三尖杉寧鹼...
紅豆杉樹皮粉碎85%～95%酒精3Time50-70℃真空減壓濃縮氯仿萃取1%氯仿膏加氯仿溶解加矽膠攪拌均勻涼乾，過篩，填裝到層析柱中氯仿-甲醇梯度洗脫紫杉醇含量5～8%丙酮溶解加矽膠攪拌均勻涼乾，過篩，填裝到層析柱中氯仿-甲醇梯度洗加矽膠攪拌均勻涼乾，過篩填裝到層析柱中丙酮-石油醚梯度洗20～25%半成品丙酮-石油醚系統結晶3～4次抽濾50℃ 真空減壓乾燥75～80%半成品目標段濃縮物丙酮-石油醚結晶紫杉醇含量≥99.5%成品高壓矽膠層析柱層析去除膠質紫杉烷化合物分離為紫杉醇、三尖杉寧鹼…!!
分離純化紫杉醇的方法：紅豆杉樹皮粉碎，85%～95%酒精35-55℃熱回流浸提三次，50-70℃真空減壓濃縮至熱測比重1.1～1.2g/ml，氯仿萃取，萃取液濃縮成膏狀，得紫杉醇含量1%氯仿膏，將紫杉醇含量1%氯仿膏加氯仿溶解完全，加矽膠攪拌均勻，涼乾，過篩，填裝到層析柱中，氯仿-甲醇梯度洗脫，TLC檢測，分段合併濃縮，得紫杉醇含量5～8%半成品，將紫杉醇含量5～8%半成品加丙酮溶解完全，加矽膠攪拌均勻，涼乾，過篩，填裝到層析柱中，丙酮-石油醚梯度洗脫，TLC檢測，分段合併濃縮，得紫杉醇含量20～25%半成品，用丙酮-石油醚系統結晶3～4次，抽濾，50℃ 真空減壓乾燥，得紫杉醇含量75～80%半成品，16Mpa壓力層析分離，TLC檢測，分段合併濃縮，目標段濃縮物丙酮-石油醚結晶，抽濾，乾燥，得紫杉醇含量≥99.5%成品;高壓矽膠層析柱層析去除膠質，同時將紫杉烷化合物分離為紫杉醇、三尖杉寧鹼、7-表紫杉醇3部分。
葡聚糖凝膠柱使用1 Sephadex G型葡聚糖凝膠只適合在水中使用，Sephadex G-25羥丙化後就是Sephadex LH-20。其既有分子篩作用，在由極性與非極性溶劑組成的溶劑中還有反相層析效果。雖然價位很高，但由于性能頗佳，可再生利用，所以倍受親睞。此外上柱樣品損失很少，對處理小樣品較好，這也是我們實驗室常用的原因之一。2 Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分離原理主要有兩方面︰以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶中）。因為凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強，最後出柱。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH20對化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強，後出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。3 Sephadex LH20 洗脫溶劑。看完第2點後，就應該清楚Sephadex LH20 洗脫溶劑因分為兩類︰反相和正相兩種。用得最多的是反相溶劑洗脫，以甲醇－－水系統最為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，最後用100％甲醇沖柱。正相系統以氯仿－－甲醇最為常見，先用50％氯仿－－甲醇，逐漸增加甲醇比例，最後用100％甲醇沖柱。4 Sephadex LH20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（甲醇－－水），樣品用最少體積的甲醇－－水（盡可能甲醇少一些）溶解，過濾後，濕法上樣（一定要濾喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得將Sephadex LH20 的柱頭部分棄去，很心痛呀）。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫（氯仿－－甲醇），樣品用最少體積的氯仿－－甲醇溶解，過濾後，濕法上樣。5 Sephadex LH-20的步驟。(1) 選擇條件︰梯度洗脫在Sephadex使用中並不象在正相柱層析中那麼重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統;極性小者一般用不含水的系統。我們實驗室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統，用了很多年，效果較好。(2) 飽和層析柱︰用洗脫劑將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降，此時要防止氣泡留在其中。至少半小時打開開關，流出幾個柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。(3) 樣品處理︰用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過濾。(4) 濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。(5) 洗脫︰控制流速，一般1drop/s以下，可參見廠家的一些參數;必要時更改極性（很多時一個極性就可以將樣品洗脫完畢）。再生以備下次使用。6 分離的技巧，最後說說我的使用心得（1） 流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達。（2）柱子盡可能長，Sephadex LH20 柱長的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優勢兵力，打擊敵人。（3） 餾分一定要接的細，可1／10，或1／20 個保留體積接成一餾分。（4）
洗脫體積一般為2-3個保留體積，對特殊保留強的化合物，可洗脫5個保留體積。（5）鞣質成分死吸附嚴重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣（6）Sephadex LH20 對黃酮類成分的分離效果極佳，方法很成型，有大量文獻參（7）填料反復使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干淨，然後用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來，待用。 Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天然產物在有機溶劑中的純化。例如︰類固醇、脂類以及小分子多醣等Pharmadex LH-20同時適用于分子類別非常相似的物質的分離和工業規模的制備，既可用于初步純化步驟，也可用于最終精制步驟，如非對映同分異構體的分離。1.裝柱裝填的重要原則之一就是需要形成一個穩定均一的柱床。膠顆粒越均一（粒徑分布越窄），越容易獲得穩定均一的柱床。但是對于Sephadex LH-20而言，25～100μm的粒徑範圍相對于釵h用于制備色譜的填料而言，不能說分布均一，也就是說其粒徑分布較寬。然而當膠溶脹後就相對容易得到均一的柱床。這對于長柱（最高至250cm）而言也是同樣的。在裝柱前，層析柱和儲槽都必須進行徹底的清洗。Sephadex
LH-20在使用之前必須進行溶脹。在溶脹的過程中，要盡量避免過分攪拌，否則會破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時，溶脹後膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統，請參考後頁之干膠溶脹表計算特定柱體積所需要干膠的量。使溶脹膠體積沉澱之後佔總體積的75%，上層溶劑佔25%，這時，懸浮液從一個容器倒入另一容器時膠粒可移動。將溶脹後的凝膠根據裝柱要求均勻倒入柱內，在保證膠粒不變形的前提下，應在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過1.5ba。2.平衡 上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個柱體積直到基線變得平穩為止，如改變溶劑應該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質，並根據性質確定柱高調節器的位置，如使用相同的溶劑，在以後的層析中柱平衡可以省略。3.洗脫液 為確保延長層析柱的使用壽命，所有的緩沖液都應該離心或經過0.45um的膜過濾以除去雜質。4.樣品 樣品體積應該佔柱總體積的1-2%，同樣在使用之前樣品應該離心或經過0.45um的膜過濾。5.洗脫 洗脫流速應根據情況而定，最大線性流速約12cm/min（反壓1.5ba），建議流速為1 -10c m/h。總體來說，較低的流速，具有較高的分辯率。6.再生 凝膠再生通常是先用2-3個柱體積的洗脫液進行清洗，如更換洗脫液，則需要重新平衡。7.體積流速與線性流速的關系
線性流速=體積流速/橫截面積8.溶脹體積
由于Sephadex LH-20的溶脹體積依賴于溶劑，所以對于不同直徑的柱可根據比例增加或減少舊柱體積以便計算出新體積。利用混和物中各組分理化性質（吸附力、分子形狀、大小、分子極性、分子親和力以及分配係數）的差異，在物質經過兩相中進行分離的一種技術。一．概念利用混和物中各組分理化性質（吸附力、分子形狀、大小、分子極性、分子親和力以及分配係數）的差異，在物質經過兩相中進行分離的一種技術。本世紀初（1903年），俄國植物學家MCJber發現並使用這一技術證明了植物的葉子中不僅有葉綠素，還含有其他色素，實際上他使用的吸附層析。現在層係法已成為生化、分子生物學及其它學科領域有效的分離、分析工具之一。
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