一．逆流色譜技術簡介
現代逆流色譜技術起源於上世紀50年代的逆流分溶法（Counter
Current Distribution, CCD），它利用不同物質在所選擇的兩相溶劑中的分配係數不同而通過多次逆流分溶對物質進行分離。它採用數百個分離管進行操作，每一次操作後，上層液體被轉移至盛有新的下層溶劑的分離管中，而往原分離管中加入新的上層溶劑，看起來好似兩相的液體以相反的方向流動，故稱為逆流分溶法。逆流分溶法存在許多缺點，如使用易破碎的玻璃儀器，分離時間長，需要連續稀釋樣品等。但與液相色譜相比，它無需固體作固定相，從而避免了因此而帶來的一系列問題。因此，在CCD基礎上發展起來的逆流色譜（Counter Current
Chromatography, CCC）在採用了與液相色譜相似的連續洗脫、檢測和分佈收集技術後從上世紀70年代開始得到迅速的發展，並在天然和合成化合物的分離純化中發揮了日益重要的作用。上世紀70年代出現的液滴逆流色譜（Droplet Counter Current
Chromatography, DCCC）使流動相形成液滴，通過作為固定相的液柱而達到分離純化的目的。其裝置主要由輸液部分、檢測收集部分和玻璃管液柱部分（300-500根60cm X 1.8mm的玻璃管）組成。由於流動相形成液滴，在細的玻璃管中與液體固定相有效地接觸，摩擦不斷形成新的表面，促進溶質在兩相溶劑中的分配，所以分離效果好，而且不產生乳化現象。對於易氧化的物質，還可用氮氣驅動流動相。採用DCCC分離純化了許多包括中草藥和抗生素在內的天然產物如柴胡皂甙和短桿菌肽,短桿菌酪素和四環素等。液滴逆流色譜解決了操作自動化的問題，但仍存在分離時間長，使用易破碎的玻璃管，分離度還不高等問題。逆流色譜技術的重大突破出現在上世紀80年代，根據被分離混合物的理化特性，選擇二元或多元的兩相溶劑體系，以上相或下相為固定相，將其註滿色譜柱後使色譜柱作特定的高速旋轉運動，並用由此產生的離心力場支撐柱內的液體固定相，然後以另相為流動相，攜帶溶解的混合物由輸入泵推入色譜柱，穿過兩個液相對流的管柱，各組分根據在兩相中的分配係數不同而得到分離。根據離心力場的不同可將現代逆流色譜分為離心分配色譜(Centrifugal Partition Chromatography, CPC)，也稱盤管行星離心色譜(Coil Planet Centrifuge, CPC)和高速逆流色譜(High
Speed Counter Current Chromatography,
HSCCC) ，前者屬流體靜力平衡系統，色譜柱由一系列刻在圓盤或圓筒內的導管相聯的柱體組成，通過單軸旋轉產生恆定的重力場，兩個旋轉密封的接口分別連接流動相的進口和出口；後者屬流體動力平衡系統，由聚四氟乙烯軟管繞製成的色譜柱除繞離心軸旋轉外，還圍繞自軸旋轉，產生變化的重力場，並採用無旋轉密封的連接方式。分離時兩相液體被劇烈振動的離心力場依其界面特徵被甩成極細的微粒，樣品各組分在兩相微粒的表面上分配並在微粒振盪與對流的環境中有效傳遞，相當於把通常的溶劑萃取高效（13次/秒以上）、自動、連續地予以完成。泡沫逆流色譜(Foam Counter Current Chromatography, Foam CCC)技術是在HSCCC的基礎上發展起來的。使用時，氮氣和流動相同時從相反方向注入管柱中形成氣體和流動相的逆流，然後從盤管中部注入的混合物根據形成泡沫的能力得到分離，易形成泡沫的的組分隨氣相被洗脫收集在泡沫流出部分，而其它組分則隨流動相流出。在盤管行星離心色譜基礎上還發展了交叉軸盤管行星離心色譜(Cross-axis Coil Planet Centrifuge, X-axis CPC)，這種儀器在使用中產生一種行星式運動，使得盤管支架在圍繞離心中軸轉動（公轉）的同時還沿著自己的水平方向軸旋轉（自轉），使得部分的離心力矢量作用於盤管的半徑方向，以防止因兩相乳化而降低固定相保留率的現象出現。因此，X-axis CPC大大穩定了固定相的保留率，特別適用於大量製備性分離純化。現代逆流色譜技術為化合物的分離純化提供了一個新的手段，與HPLC等液-固色譜技術比較，由於分離原理不同，二者間存在很強的互補性。它無需固體作固定相，不存在固體對樣品組分的吸附、玷污、變性、失活、拖尾等現象，能實現很高的回收率，節省
昂貴的材料消耗和溶劑消耗（HPLC的1/ 10以下），運行使用的後續投入較低。逆流色譜在無需更換不同極性的色譜柱情況下，通過提高極性溶劑或非極性溶劑比例的方法，可以實現流動相從弱極性到強極性或相反的轉化。由於色譜柱容積大，無填料，柱內空間全部是有效空間，因此，樣品負載能力強，製備量大，重現性好。實驗室規模的盤管總體積為100mL的逆流色譜儀一次可分離0.5-2克的麤品，而3000mL容量的製備型逆流色譜儀一次可分離15-60克的麤品。但是，與氣相色譜和高效液相色譜等相比，逆流色譜的分離效率即理論塔板數還不高（一般在1000以下），一次分離所需時間還較長（以小時計），因此，還不宜用於組成複雜的混合物的全譜分離分析。逆流色譜技術在基本原理以及溶劑系統選擇等方面還有待於進一步的普及、研究、開發與應用。目前，HSCCC等技術在生物化學、醫藥學、農業、環境、材料、化工、海洋生物以及無機離子等眾多領域已得到成功應用，1996年美國出版的《High-Speed Countercurrent Chromatography》一書被選編為著名的分析化學叢書第132卷，2000年9月在英國Brunel大學召開了逆流色譜技術第一屆國際學術會議，每年一度的國際分析化學與應用光譜學學術會議上，都設有CCC的專題組，“Journal of Chromatography”
,“Journal of Liquid Chromatography”等重要學術刊物都有這一技術的論文發表。我國在CCC技術及其應用研究方面與國際發展同步，1980年研製出了我國第一台逆流色譜儀，並用於國產抗敵素成分的分離與分析檢定，發表了一大批用HSCCC等分離製備中草藥和茶葉等天然產物活性成分的論文，引起國際同行的矚目，2002年在北京召開了逆流色譜技術的第二屆國際學術會議。但是，在逆流色譜技術應用於抗生素的分離純化方面，我國與國際上發展趨勢相比還存在很大差距，相關論文甚少，因此，在我國開展高速逆流色譜技術分離純化抗生素的工作有著廣闊的應用和發展前景。
二．溶劑選擇無論是用HPLC或CCC技術分離混合物，分離度(Rs)是一個很重要的參數，如下圖所示，在HPLC中，提高分離度是通過使峰形變窄的方法達到的，而在CCC或CPC中，則是通過改進選擇性來實現的，這種選擇性主要取決於樣品在兩相溶劑中的分配係數。因此，溶劑系統的選擇在CCC技術中尤為重要。選擇溶劑時要考慮到樣品的極性、溶解度、電荷態和形成複合物的能力等，溶劑體系的沉降時間應小於30秒，以得到滿意的固定相保留率。測定方法如下，各取2毫昇平衡 後的上相和下相液體移入一個5毫升的刻度玻璃管中，密封上下搖動5次後靜置於水平面上並測定兩相分層的時間即沉降時間。樣品的分配係數K值（K=上相中樣品濃度/下相中樣品濃度，可由HPLC方法得出）最好在1左右，一般在0.2到2之間。以上相作固定相時為例，若K《《1，樣品很快隨流動相流出，達不到分離效果；若K》》1，樣品出峰時間拉長，形成寬峰。由於CCC的理論塔板數在800左右，因此要得到高的分離度，樣品各組分間的分離因子(?,各組分的K值之比)應大於1.5。此外，兩相溶劑的體積應盡量相同以避免溶劑的浪費，溶劑最好揮發性強，這樣完成操作後只要將洗脫液濃縮即可得到純樣品。選擇溶劑體係時，首先選出一個能使樣品全部溶解的溶劑體系，然後調整各溶劑的比例使得被分離各組分滿足K值和?值的要求，以提高分離度。可以採用相圖來研究改變某一相的組成對另一相組成的影響，Sørensen等人對近百種三元溶劑相圖研究後，總結歸納出三類溶劑體系：乙酸乙酯—正丁醇—水(EtOAc—BuOH—H2O)，適用於極性弱的樣品；水—二甲亞砜—四氫呋喃(H2O—DMSO—THF)，適用於極性強的難溶性樣品如兩性黴素B；氯仿—甲醇—水(CHCl3—MeOH—H2O)，適用於大部分樣品。此後又發展了其它通用的多元溶劑體系如正戊烷—乙酸乙酯—甲醇—水(Heptane—EtOAc—MeOH—H2O)體系和正戊烷—甲醇—甲基叔丁基醚—甘醇二甲醚—水(Heptane—MeOH—MtBE—Glyme—水)體係等。常用溶劑體系的選擇可參考表1，首先根據樣品的理化特性選出最佳溶劑，然後在左右兩欄中再選擇相應的數種溶劑，以組成選擇性最好的多元溶劑體系。 表1最佳溶劑體系選擇表極性較弱溶劑最佳溶劑極性較強溶劑heptane, CHCl3 THF
H2O heptane, toluene, MiBK, CHCl3, EtOAc ACO H2O heptane methyl ethyl ketone
H2O THF DMSO H2O toluene, MtBE, MiBK , EtOAc MeCN H2O heptane, toluene, CHCl3,
EtOAc BuOH H2O heptane, toluene, CHCl3, EtOAc PrOH H2O heptane, CHCl3, EtOAc
EtOH H2O heptane, toluene, CHCl3, EtOAc, BuOH MeOH H2O heptane, toluene, CHCl3,
MiBK, EtOAc, BuOH HOAc H2O CHCl3 HCOOH H2O 非水體系Heptane
THF, DMF, EtOAc, PrOH, EtOH MeOH, MeCN heptane,正戊烷；CHCl3，氯仿；THF，四氫呋喃；toluene，甲苯；MiBK，甲基異丁基酮；EtOAc ， 乙酸乙酯；ACO，丙酮；DMSO，二甲亞砜；MtBE，甲基叔丁基醚；MeCN，乙腈；BuOH，正丁醇； PrOH，正丙醇；HOAc，乙酸；HCOOH，甲酸；DMF ，N,N-二甲基甲酰胺。三．逆流色譜技術在抗生素分離純化中的應用逆流色譜技術已經成功用於許多抗生素的分離純化，這些抗生素的結構類型有肽類、大環內酯類、四環素類、蒽環類、放線菌素類、多烯類、核苷類、醣類和頭孢類等，詳見表2。表2逆流色譜分離的部分抗生素
樣品儀器溶劑系統流動相發表時間肽類短桿菌肽A,B,C DCCC C6H6-CHCl3-MeOH-H2O LP
1974
HSCCC C6H6-CHCl3-MeOH-H2O LP 1982
短桿菌酪肽DCCC CHCl3-MeOH-0.1MHCl LP 1974
多粘菌素E（抗敵素） CPC
n-BuOH-2%CHCl2COOH(5%NaCl) LP 1984
多粘菌素分析HSCCC n-BuOH-0.04M TFA(1% glycerol) LP 1991
桿菌肽x-axis CCC CHCl3-95%EtOH- H2O LP 1989
Foam CCC N2, H2O 1989, 1991
HSCCC CHCl3-MeOH-H2O LP 1991
HSCCC CHCl3-EtOH-MeOH-H2O LP 1991
WAP-8294A HSCCC n -BuOH-EtOAC-0.005M TFA LP 2001
四環素類 土黴素/氯黴素CPC n-BuOH-0.01MHCl
LP 1984
四環素/雜質CPC nitromethane-
CHCl3-pyridine-0.1MEDTA(pH7) LP 1984
四環素DCCC CHCl3-MeOH -n-PrOH-0.01MHCl LP 1984
大環內酯類Niphimycin DCCC CHCl3-MeOH-H2O LP 1983
紅黴素CPC MiBK-AcO-0.2M phosphate/ citrate buffer(pH6.5)
LP 1984
2-去甲基紅黴素HSCCC n-C5H12-C6H6-AcO-iPrOH-0.01M citrate
buffer(pH6.3) UP 1988
尼達黴素HSCCC CCl4-MeOH-0.01MK3PO4 buffer(pH7) UP 1988
Tiacumicins HSCCC CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1988
Coloradocin HSCCC CHCl3-MeOH-H2O UP 1987,1988
孢綠菌素HSCCC n-BuOH-Et2O- H2O LP 1990
黴菌素分析HSCCC n-C6H14-EtOAc-MeOH-8%NH3.H2O LP 1991
Dunaimycin HSCCC n- C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 1991
原始黴素HSCCC CHCl3- EtOAc-MeOH-H2O UP 1992
伊維菌素HSCCC n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O LP 1996
螺旋黴素HSCCC n-C6H14-EtOAc-MeOH- H2O UP 2000
蒽環類 道諾紅黴素衍生物HSCCC CHCl3-CH2Cl2-nC6H14- MeOH-H2O UP 1981
阿黴素/道諾紅黴素CPC n-BuOH-0.3M
Na2HPO4 LP 1984
/代謝物
Benzanthrins A, B HSCCC CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1986
Altromycins CCC CCl4-MeOH-H2O, n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O LP 1990
喹喔啉類 棘黴素/醌黴素CPC ACO-
H2O-nC5H12-EtAcO LP 1978
三骨菌素A/棘黴素CPC CCl3CH3-MeOH-H2O
UP 1978
放線菌素類
放線菌素混合物HSCCC Et2O-nC6H14-MeOH-H2O UP 1986
多烯類 曲古黴素CPC CHCl3-MeOH- borate buffer UP 1984
Globoroseamycin CPC CHCl3-MeOH-borate buffer UP 1984
制黴菌素CPC CHCl3-MeOH-borate buffer LP 1984
呋羅托黴素HSCCC CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1985
克念菌素HSCCC CHCl3-MeOH- H2O UP 1987
核苷類
Herbicidins A, B CCD CHCl3-MeOH-H2O LP 1976
頭孢類其它
Pentalenolactone HSCCC CHCl3-MeOH-H2O UP 1985
（內酯）
Tirandamycin A, B HSCCC n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 1985
Siderochelin A HSCCC CHCl3-MeOH-H2O UP 1985
A 201E HSCCC CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1985
Bu 2313B HSCCC n-C6H14-CH2Cl2- MeOH-H2O LP 1985
SCH 42282 HSCCC CHCl3-MeOH-H2O UP 1998
(含糖大環內酰胺)
深圳市同田生化技術有限公司
電 話：0755-26551496
傳 真：26551496
服務公司：深圳市同田生化技術有限公司
電子郵件：tauto@szonlin.net 深圳市同田生化技術有限公司成立於1999年2月份，現位於深圳市高新技術產業園清華大學研究院內，是世界上第一家多分離柱高速逆流色譜儀的專業生產企業，公司擁有自主知識產權的多分離柱高速逆流色譜專利技術，現已研製並生產出ＴＢＥ系列分析型、半製備型、製備型高速逆流色譜儀，其技術已達國際領先水準。2002年同田生化與安瑪西亞中國有限公司建立合作夥伴關係，合作推出AKTA-TBE300A高速逆流色譜系統。高速逆流色譜主要用於生物化學、農業、海洋生物、無機化學等領域，特別在中藥領域中已被認為是一種新型有效的檢測和分離純化技術，我公司已利用高速逆流色譜分離出十餘種植物有效單體產品，如：異鼠李素、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、大豆甙、大豆甙元、染料木甙、染料木素、虎杖甙、蛻皮甾酮等，純度均達99％以上，可用於有效成份的純度對照。深圳市同田生化技術有限公司是一家專業生產植物有效成份對照品的公司，現有銀杏黃酮對照品：異鼠李素、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、山萘酚、槲皮素現貨提供，純度均達到99%以上，可用於銀杏黃酮的純度對照及保健品，亦能根據用戶的需要開發新產品。公司還研製了系列具有自我知識產權的新型高速逆流色譜系統（HSCCC），能為廣大科研院所提供最先進的分離純化設備。歡迎廣大新老客戶來電來函與我們建立良好的貿易合作關係！
本文作者等用國產分析型TBE-300高速逆流色譜儀（深圳同田生化技術有限公司）對含環孢菌素A、B、C、D的混合物進行分離，以石油醚/丙酮/水（V/V 3：3：2）為溶劑系統，下相為流動相，運行8小時後，得到純度大於98.5%的A、B、C、D各組分，收率 高於85 %。事實證明高速逆流色譜技術在抗生素分離純化方面大有可為。四．逆流色譜技術的新進展1.梯度洗脫逆流色譜：高速逆流色譜通常使用恆定比例的溶劑系統，但是對於組分極性變化大的樣品，用恆定比例的溶劑系統難以達到分離效果。此時可以像HPLC一樣採用梯度洗脫的方法進行分離。先用簡單的梯度洗脫系統如水-乙腈（100:0?O:100）用HPLC對樣品進行極性掃描分析，選擇適當的溶劑系統，如正己烷-正丁醇-甲醇-水（極性化合物）；正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（中極性化合物）和正己烷-乙腈（非極性化合物），然後逐漸改變系統中某一溶劑的比例，如將正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系中甲醇的比例從0.1逐漸提高到2.5並求出不同甲醇比例時的分配係數以優化溶劑系統，最終得出最佳梯度洗脫系統。花色素苷(anthocyanins)是一種類黃酮類植物色素，是很好的抗氧化劑和自由基清除劑。由於結構中羥基和糖苷基的數目不同而使各組分的極性不同。以乙酸乙酯-正丁醇-水(0.2%TFA)為溶劑系統，採用逐漸提高流動相中正丁醇比例的方法對樣品進行梯度洗脫逆流色譜，一次既可分離出5個活性成分。2. pH區帶逆流色譜：pH區帶逆流色譜(pH-zone-refining CCC)的洗脫色譜圖形與頂替色譜和等速電泳相似，主要組分的峰組成一系列矩形色譜峰，各色譜峰之間很少重疊，一般針對可離子化的分子如羧酸、胺等。操作時選擇兩相體系如甲基叔丁基醚-水，平衡後取上層溶劑加入適量的作為“保留劑”的酸如三氟乙酸並作為固定相，下層溶劑加入適量的作為“取代劑”的鹼如氨水並作為流動相。以分離有機酸R1COOH、R2COOH、R3COOH（pKa1《pKa2《pKa3）為例（圖1），首先將酸化的固定相注入色譜柱中，然後加入用固定相溶解的樣品。泵入流動相後，在色譜柱足夠長的情況下整個體系達到“等速”狀態，與氨水界面移動的速度同步。酸性較強的R1COOH先與氨水作用，轉化為R1COO-和NH4+，但R1COO-隨即被酸性更強的CF3COOH質子化，又變為R1COOH回到固定相，CF3COO-和NH4+先洗脫出。同樣，在CF3COOH消耗完變為CF3COO-後，R1COOH提供質子，使R2COO-轉化為R1COOH留在固定相，直至所有的R1COOH轉變為R1COO-，並隨流動相洗脫出，形成R1COO-的矩形色譜峰。與此類推，其次洗脫出的是R2COO-矩形峰，最後是R3COO-的矩形峰。由於在所有的R1COOH轉變為R1COO-前，R2COO-不會洗脫出，因此，R1COO-在色譜圖上形成矩形峰，與R2COO-很少重疊，R2COO-和R3COO-的峰也是如此。圖1 pH區帶逆流色譜分離有機酸示意圖 同樣，若被分離的樣品是鹼類如生物鹼等，也可以鹼為保留劑，酸為取代劑，進行pH區帶逆流色譜分離。此外，也可以選擇下相溶劑為固定相，上相溶劑為流動相，因此，pH區帶逆流色譜擴大了逆流色譜的應用範圍，提高了樣品的進樣量，可進行製備性的樣品分離，在氨基酸及其衍生物、多肽、氧雜蔥染料、生物鹼、多酚和異黃酮類等化合物的分離方面得到應用。如用正丁醇-0.03mol三氟乙酸(1:1)分離了粘菌素；用正丁醇-0.2mol甲酸氨分離了縮膽囊素。pH區帶逆流色譜也可以用於有機酸對映體的分離，如下圖中1-甲基-4-甲氧甲基環己基甲酸的兩個異構體由於立體位阻效應不同而使酸性產生差異，從而得到分離。3.離子交換頂替離心分配色譜:離子交換頂替離心分配色譜(Ion-exchange displacement CPC)的原理與pH區帶逆流色譜相同，但後者針對可離子化的分子如羧酸和胺類，而前者特指離子化的化合物即在任何pH值的情況下都帶電的化合物如有機磺酸鹽和季胺鹽等。從褐色海藻中提取出一種多取代硫酸多醣，以硫酸岩藻糖為基本單元的聚合體上還含有半乳糖、木糖和醣醛酸。這種帶多個負電荷的高極性聚合物(Fn-, Fn-1-, F2-, F1-等)易溶於水，不適合用離心分配色譜等進行分離，但引入離子交換頂替方法後可以用CPC等逆流色譜予以分離。操作中採用了一種液相離子交換樹脂Amberlite LA2，這是一種高分子油溶性二級胺，在大部分有機溶劑中溶解性良好而在水相中溶解性極低。將LA2溶解在甲基異丁基酮等有機溶劑中並用鹽酸質子化，將有機相作為固定相，樣品用固定相溶解後注入色譜柱，以含OH-的溶液為流動相進行離子交換頂替離心分配色譜分離，其分離原理與pH區帶逆流色譜相同（圖2），最終被樹脂吸附最弱的多醣先洗脫出，最後出來的是吸附最強的組分。圖2離子交換頂替離心分配色譜分離硫酸多醣示意圖4.手性分離逆流色譜:手性分離技術已經在高壓液相（HPLC）、氣相(GC)和毛細管電泳(CE)中得到廣泛應用，但在逆流色譜中應用很少。主要困難在於尋找適合的手性選擇劑，它們在液相和混合溶劑中都要有很高的選擇性，並且能將所要分離的手性異構體洗脫出。儘管進展不大，但下列開拓性的工作值得重視：源自HPLC技術的以N-十二烷酰-L-脯氨酰-3,5-二甲基苯胺和萬古黴素為手性選擇劑的工作以及源自CE技術的以?-環糊精為手性選擇劑的工作。
N-十二烷酰-L-脯氨酰-3,5-二甲基苯胺是?電子供體化合物，能將天然氨基酸的N-(3,5-二硝基苯甲酰基)-叔丁基衍生物（DNB-氨基酸）的對映體快速和完全分離。研究發現若增加固定相中手性選擇劑的量或濃度以及調整溶劑系統的憎水性使對映體的分配係數在0.6和0.8之間（pH區帶逆流色譜除外）的話，可以在330mL的色譜柱中用CCC儀器將1克的DNB-氨基酸外消旋體分離，採用pH區帶逆流色譜，分離量可達2克。(3R,4R)-7-des-methyl-ormeloxifene是部分雌激素受體激動劑(-)-(3R,4R)-levormeloxifene的主要體內代謝產物，對(3R,4R)-7-des-methyl
-ormeloxifene及其(3S,4S)的對映體進行毛細管電泳分離時，以硫酸化?-環糊精為手性選擇劑，分離度可增加十倍，達到100以上。但毛細管電泳的分離量太少，於是，將此技術應用於逆流色譜，選擇取代度為7到11的硫酸化?-環糊精為手性選擇劑，以10:1:9的乙酸乙酯—甲醇—三乙銨乙酸鹽溶液為溶劑系統並在固定相中加入2%(W/V)的硫酸化?-環糊精，可很好地將上述對映體拆分。
萬古黴素作為一種通用和高效的手性選擇劑已應用於液相色譜、薄層色譜和毛細管電泳，並成功地拆分了許多對映體如氯殺鼠靈、華法林、萘氧丙草胺、5-甲基-5-苯基乙內酰脲和各種氨基酸衍生物。萬古黴素易溶於水，在甲醇中也有一定的溶解度，但不溶於高級醇和其它較低極性的有機溶劑。因此，以萬古黴素為手性選擇劑進行CCC和CPC拆分時，通常採用兩相繫統：含萬古黴素的水相固定相和富含對映體的低極性的有機流動相。這樣，分配係數K值在0.5到1之間，有利於快速回收。採用甲苯和140mg/ml萬古黴素溶液（pH4.7）組成的兩相繫統，分別以CCC儀器（13mL分離柱）和CPC儀器(90mL分離柱)對正亮氨酸的丹磺酰衍生物進行對映體拆分。由於D對映體傾向於保留在萬古黴素溶液相中，而L對映體傾向於保留在有機相中，因此，D,L對映體與作為固定相的萬古黴素溶液一起注入，當L對映體隨有機流動相洗脫出後，以有機相為固定相，萬古黴素溶液相為流動相，將D對映體洗脫出，達到拆分目的。使用CPC儀器，在50分鐘內可將50毫克的對映體拆分開。雖然上述逆流色譜新技術的應用與其它色譜新技術相比，還有待於普及和推廣，特別是在抗生素分離純化方面，更顯得薄弱不足。希望抗生素界的廣大同行一起努力，學習、應用和推廣逆流色譜這一分離技術，使它在抗生素行業異軍突起，生根發芽，發揮它應有的作用。致謝：本所方東昇工程師在本文的寫作過程中給予許多幫助，並在高速逆流色譜分離環孢菌素混合物中做了具體工作，特此致謝。主要參考文獻：
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